J AM CHEM SOC.|1-芳基-2-烷基炔烴一級胺化的酶促平臺

大家好，今天推送的文章來自於發表在Journal of the American Chemical Society上的“An Enzymatic Platform for Primary Amination of 1‑Aryl-2-alkyl Alkynes”，作者為加州理工學院化學化工學院的Frances H. Arnold。

對炔丙基胺是有機合成和藥物化學中的一類重要分子。1−3該基序廣泛存在於許多生物活性分子中，如藥物及其類似物。

炔和胺的官能團組合也使它們成為具有複雜結構的多功能合成中間體。製備丙炔基胺的常用方法有:氮親核試劑丙炔基取代法、炔基酮還原胺化法和亞胺炔基化法。這些方法雖然有效，但需要使用有害的有機金屬試劑或炔基底物在丙炔位的預功能化。硝基C−H直接插入反應是由簡單炔合成丙炔胺的一種有吸引力的替代策略。然而，這些底物的C−H選擇性胺化極具挑戰性。一方面，高反應性的硝基化合物通常對不同的功能(例如，已知的炔的三鍵與硝基化合物反應)和C - H鍵不加區分，導致低化學和區域選擇性和不可控的副反應。另一方面，炔基相對較小的空間效應也成為小分子催化中對映異構分化的問題。儘管如此，自2018年以來，已經開發了幾種基於鈷、銥、釕和銀的不對稱分子內丙炔胺化反應催化系統(方案1b)。然而，據我們所知，文獻中只有一個對映選擇性分子間丙炔C(sp3) - H胺化的例子，它使用全氟芳基疊氮化物作為硝基前體。

自2013年以來，生物催化硝基轉化已成為構建含氮分子的有力工具。幾個實驗室已經證明，酶促硝基甲烷C−H插入反應可以在各種底物上實現良好的效率和選擇性。在2020年，作者就報道了一種前所未有的使用P411酶(細胞色素P450，以絲氨酸代替半胱氨酸作為軸向配體)的苄基和烯丙基C - H鍵的一級胺化反應。P411酶在馴化高度反應性的無保護硝基物種的同時，也允許精細的立體控制，這一顯著能力證明了它們在其他具有挑戰性的轉化方面的催化潛力。因此，作者假設P411酶可能是合適的丙炔胺化催化劑。在這項工作中，作者證明了一個工程P411突變體，即PA-G8，來自細胞色素p450bm3並透過定向進化改進，具有良好的對映選擇性和催化效率催化分子間丙炔胺化反應。

作者開始了對酶促炔丙基胺化的研究，重點是1-苯基丁烯和鄰新戊醯羥胺三羧酸之間的反應。與我們先前工作中使用的疊氮化物前體相比，基於羥胺的硝基苯前體更穩定、更安全。預期的伯胺產品具有生物學意義，可透過下游轉化輕鬆轉化為其他有價值的化合物。首先用一組血蛋白對反應進行評估，這些血蛋白以前是為不同的硝基烯和卡賓轉化而進化的，以大腸桿菌（E.coli）細胞催化劑的形式存在。儘管大多數變體沒有顯示出對該反應的可檢測活性，但來自烯丙基初級胺化譜系的一些P411酶確實顯示出有希望的初始活性。其中最好的酶（P411-b4）可以以64%的產率催化標準反應，儘管對映選擇性可以忽略不計。P411-b4的血紅素結構域有四個突變體（A78M、L263M、G268P和L437G），P411-b4的血紅素結構域有四種突變(A78M, L263M, G268P，和L437G)，與作者之前報道的p450bm3的“E10”變體的苄基C - H糖基胺化有關，該變體具有解好的晶體結構。

突變體P411-b4被選為定向進化的親本。位點飽和突變（SSM）文庫是透過重新訪問先前P411催化轉化的有益位點來生成和篩選的。為了減少SSM輪中的篩選負擔，僅對與母體相比活性超過60%的變體進行對映選擇性分析。令人滿意的是，透過引入單一突變E267D，我們獲得了一個新的突變體PA-G1，它能夠以接近定量的產率和28%的ee催化模型反應。另外七輪SSM和篩選產生了最終的突變體PA-G8，它可以以優異的產率和對映體控制（79%的分析產率和88%的ee）進行炔丙基胺化。突變體E267D、G437Q和S438G，它們位於柔性環和血紅素輔因子正上方的α-螺旋上。所有突變體（E267D、N395C、G437Q、S72T、S438G、T269V、H266S和A74K）都是為了提高對映選擇性而選擇的，儘管其中一些突變體減少了轉化率。

在確定了模型底物1a的丙炔胺化的最佳突變體pa - g8後，作者接下來在標準全細胞反應條件下評估了該酶在一系列炔基底物(1b−1n)上的活性。一般來說，pa - g8接受許多1-芳基-2-烷基炔，提供所需的產品具有良好到優異的對映選擇性(82 - 96%ee)。烷基鏈較長的炔烴可以轉化為相應的丙炔胺(PA-G8)，但產率較低。有趣的是，鏈長的增加與對映體選擇性的提高相關(分別為91%和96%的ee)。此外，具有不同取代模式的芳香基在該反應中具有良好的耐受性，包括具有不同電子性質的芳香環阿託、間位和對位取代基(3d−3i)。含雜芳環的炔烴也可作為活性底物(3j−3l)。這是值得注意的，因為許多過渡金屬基催化系統不與雜環相容，特別是吡啶，因為它們傾向於使過渡金屬催化劑失活。pa - g8除能催化硝基進入二級C(sp3)−H鍵外，還能催化一級和三級C - H鍵(3mand3n)的胺化反應。雖然某些炔烴的反應產率相對較低，但15我們相信它們可以透過進一步最佳化這些“丙炔氨基酶”而得到改善。我們還測試了pa - g8與二烷基炔，例如，3-己炔。

最後，作者利用截斷體系進行密度泛函理論（DFT）計算，探討了炔丙基碳（sp3）中硝基烯插入的性質−使用模型基質1a的氫鍵。DFT計算描述了假定的鐵−類硝基活性物種為三重態基態，與報道的類似鐵離子一致−類硝基植物。計算表明，硝基苯插入透過氫原子轉移（HAT）步驟進行，在三種狀態中，最初形成炔丙基自由基中間體，然後經歷自由基反彈步驟生成最終炔丙基胺產品。這類似於之前描述的分子間和分子內硝基烯磺胺類鐵硝基和醯基類鐵硝基。

自由基的回彈步驟比先前報道的叔C(sp3) - H鍵的對映收斂胺化反應快得多(約高10千卡·mol−1。)丙炔基的快速捕獲表明，由於空間限制，在活性位點上的反彈過程優於自由基的重定向和烷基的旋轉。因此，底物(1a)和丙炔基在活性部位有相似的方向。氨化反應的對映選擇性取決於反應過程中丙炔基的取向。實際上，胺化過程的選擇性是由pa - g8活性位點上的底物與活性類硝基鐵的結合位相控制的。這與烷基鏈較長的底物(3b和3c，對映體選擇性的提高是一致的，在結合袋中，對映體的幾何約束更大。

綜上所述，作者建立了一個高對映選擇性硝基丙炔C - H插入反應的生物催化平臺，得到了一組合成有用且生物相關的丙炔胺產物。這項工作代表了分子間丙炔C - H胺化反應的第一個例子，透過一個假定的未取代的硝基中間體。透過8輪迭代的定向進化，確定了P411變種pa - g8，它能以良好的效率和選擇性(高達79%的產率，>2000 TTN和96%的ee)催化理想的反應。此外，pa - g8還可以接受一系列不同取代炔烴底物。DFT計算揭示了硝基插入的機制，表明酶活性位點在控制過程選擇性方面的關鍵作用是精確定位底物與鐵-硝基類物質。未來的工作將集中於將“丙炔胺酶”用於更廣泛的底物，如二烷基炔，並基於實驗室進化過程中引入的新突變研究立體選擇性的起源。對硝基中間體的進一步表徵對於推廣這一過程也是有價值的。作者設想這種酶一級胺化體系可以應用於生物活性手性胺的製備，用於合成化學和藥物發現。