1. Western Blot原理
Westernblot的原理是蛋白質在電力場的作用 下，由大到小的進行排列，利用電泳進行分離和富集。擁有抗原表位的蛋白質分子被抗體（一抗）特異性識別並與之結合。在此基礎上，酶或熒游標記的二抗識別並結合一抗，透過與底物反應顯色來觀察目的蛋白。
Westernblot顯色的方法主要有以下幾種：（1）放射自顯影（2）底物化學發光ECL（3）底物熒光ECF（4）底物DAB呈色。現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色。大部分Westernblot顯色底物是化學發光底物，發表文章通常也是用底物化學發光ECL。
2. 目的蛋白訊號弱或無
在Westernblot發光檢測中常見的問題之一就是目的蛋白訊號弱或無。首先考慮是否轉膜不充分/過轉，如果是，則要最佳化轉膜條件；其次，在轉膜合適的前提下考慮是否抗體-抗原敏感性過低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以透過加大上樣量/提高抗體濃度/使用敏感底物/延長壓片時間解決。凝膠太厚，曝光時間短也會使蛋白訊號降低，因此，要延長轉膜時間和膠片的曝光時間。
3. 非特異性條帶
非特異性條帶與抗體交叉反應有關。單抗比多抗特異性好，純度高，另外適當稀釋一抗/二抗濃度，也是有必要的。如果樣本在處理過程中發生降解，則樣本處理時加入蛋白抑制劑在冰上操作。
4. 顯影后膜上條帶處變為黃色或白色
可能是HRP過高導致的敏感性或背景太高，應降低抗體濃度。
5. 條帶內無顯影的白點
一般是與轉膜和顯影的操作有關，轉膜前儘量將膜平衡，並注意膠和膜之間避免氣泡，顯影時膜與X光片間也應避免氣泡。
6. 存在散在小圓斑
牛奶封閉液中的雜質顆粒導致，解決此類問題可提前配置好封閉液於4度儲存，使用時勿混勻，僅用上層。
7. Western Blot化學發光(ECL)淬滅的原因？
Western Blot“淬滅”的原因主要在兩方面：含HRP的抗體和發光試劑。由於長期應用某種發光試劑，人們多注意了抗體，不知道發光試劑其實也會對實驗結果造成重大影響。對抗體方面來說，可以採用適當降低抗體的濃度，發光實驗時快速操作來解決“淬滅”的問題；對發光試劑來說，可以選用發光穩定的發光試劑來解決“淬滅”的問題。
8. Western Blot背景太高
背景深是在Western blot發光檢測中最常見的問題，造成背景深的原因很多。第一，封閉的問題，封閉條件一般為5%牛奶或BAS室溫封閉2-4h，但最好4度過夜；實際上牛奶對於多數抗體來說效果不錯，但二抗與牛奶可能有交叉反應，因此洗滌很重要。另外BSA蛋白單一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脫不徹底也會導致背景深，適當增加洗脫時間、次數、用量可以減輕背景顏色，有時候膜沒有完全均勻的浸潤也是原因之一。第三，條帶背景深也與曝光時間有關，曝光時間超過半小時出現背景是很正常的，所以可以的話建議曝光1-10min。第四，抗體濃度太高也會導致背景高，建議實驗前進行檢測。
9. Western Blot中Tween-20的作用是什麼？應該怎麼用？
Tween-20是一種非離子型表面活性劑。用途為水包油乳化劑、可用作溶劑、擴散劑、穩定劑、潤滑劑和抗靜電劑等。氣相色譜固定液(最高使用溫度120℃)分離分析揮發油、脂肪酸酯、醇、酮和鹵化物。Westernblot的操作流程中大部分都用到TBST洗液，而且還是封閉，一抗二抗孵育這種比較關鍵的步驟。通常Tween-20作為一種非離子型表面活性劑，效果和SDS、BSA作用差不多。由於膜上結合的蛋白會因為一些去汙劑而被代替，因此在封閉時可使用Tween20清除去汙劑，而且濃度不要超過0.3%（0.05%效果最好），如果牛奶封閉效果不好可以提高吐溫濃度。
在WB洗液裡的吐溫是和BSA一樣，對抗原抗體蛋白提供保護作用，同時因為是表面活性劑（司盤加成親水的環氧乙烷基團後的化合物），可以減少抗體對抗原的非特異性作用，用於洗脫未結合的抗體、減少非特異性結合。Tween-20是我們用TBST的時候Tween-20得用量是0.5ml/L，不加SDS。
10.出現變形條帶
凝膠存在氣泡或是雜質、電流不穩定、凝膠冷切不均勻。制膠器具和電泳槽保持乾淨，換新的電解液，保證材料無汙染，制膠過程中清除氣泡。如電泳槽老化建議換新。儘量選擇中間孔加入樣品，避免兩端上樣。
