來源：基因talks
MRD之路不易，且行且珍惜！
ctDNA-MRD檢測金標準方法是什麼？有沒有文獻提過？答案文章告訴你！
當前一代經批准的液體活檢很簡單。分析血液樣本中的特定蛋白質，如前列腺特異性抗原（PSA）和癌胚抗原（CEA），它們是明確的癌症訊號。然而，現有的測試會優先考慮靈敏度——檢測這些蛋白質的能力——因此，它們往往具有很高的假陽性率。這種降低特異性的測試會導致過度診斷和過度治療，這往往是有害的。
以ctDNA為主的新一代液體活檢正在迅速發展。同時，歸功於高準確度NGS技術的出現，顯著提高了ctDNA液體活檢的準確性和檢測限，臨床醫生越來越多地使用基於NGS技術的ctDNA液體活檢作為指導他們臨床實踐的工具。
在實體瘤中，一些腫瘤患者在接受治療後疾病仍會復發，可能的原因是患者體內持續存在的殘留腫瘤細胞，我們稱為微小殘留病灶（MRD）：患者沒有肉眼可見的病灶，但確實存在標準臨床影像方法無法檢測到但最終會導致癌症復發的微小病灶。基於腫瘤特異性基因組改變的存在，ctDNA檢測和表徵是檢測分子殘留病灶（MRD）最常用和研究的方法。
近年來，基於NGS技術的ctDNA-MRD的臨床資料和證據越來越多，開啟了實體瘤MRD檢測的熱潮。實體瘤ctDNA-MRD檢測的技術流派主要分為兩大類：
1）Tumor-informed assays（腫瘤知情分析）
對原發腫瘤組織進行測序以鑑定患者的特異基因組變異圖譜，然後設計引物定製panel進行個性化的ctDNA檢測分析。代表產品有Natera公司的Signatera（個性化，組織-血漿）。
▲ Signatera工作流程
2）Tumor-uninformed assays（腫瘤不知情分析）
無需原發腫瘤組織，僅依賴於一組預先選定引物/探針設計與癌症型別相關的固定panel（通常多組學）進行ctDNA檢測分析。代表產品有Guardant Health公司的Guardant Reveal（非個性化，僅血漿）。
▲ Guardant Reveal工作流程
目前，基於ctDNA檢測MRD仍然是一個複雜的問題，尚未“標準化”。所以，關於ctDNA-MRD的技術流派之爭也一直沒有停息過。
2021年4月29日，Guardant Health首次公開線上發表Guardant Reveal的研究資料：MRD檢測靈敏度達到91%，特異性達100%，支援了僅血漿ctDNA-MRD檢測（Tumor-uninformed assays）的潛在臨床應用。1
2021年5月7日，Natera在其商業廣告和促銷中貶低Guardant Reveal資料，暗示Guardant Reveal“不準確和/或不敏感”並斷言其各項指標（包括靈敏度、失敗率、陰性預測值和風險比）均不如Signatera的ctDNA-MRD檢測（Tumor-informed assays）。2
2021年5月28日，Guardant Health向聯邦法院對Natera提起訴訟，指控Natera虛假廣告、不公平競爭和非法貿易行為，涉及其對Guardant Reveal的誤導性陳述。3
2021年5月28日同日，Natera發表宣告進行反擊。並向美國得克薩斯州西區地區法院對Guardant Health提起訴訟，指控Guardant Health使用虛假和誤導性的宣告來欺騙醫生關於其ctDNA-MRD檢測的效能，違反了《蘭納姆法案》。4
2021年6月18日，Guardant Health更正其4月30日的新聞稿進行反擊，表明Guardant Reveal純血液ctDNA-MRD檢測以行業領先的靈敏度預測結直腸癌復發的風險，而無需腫瘤組織，並diss組織依賴性ctDNA-MRD檢測以前報告過一次手術後抽血的靈敏度僅為40-50%。5
MRD兩大技術流派之爭，好不熱鬧！
Natera及其合作者：你欺騙！
2021年7月，Natera“氣不過”，聯合其臨床研究合作者向CCR編輯寫了一封信。6
2021年12月，CCR線上刊發“結直腸癌患者僅血漿ctDNA-MRD檢測-信件”。
該信件指出：
1）Guardant Reveal的研究中使用了界標分析（landmark analysis），非常規地包括了手術後和輔助治療後ctDNA-MRD評估，這兩個時間點的目標明顯不同：手術後ctDNA-MRD評估有助於確定患者是否可以從輔助治療中獲益，而輔助治療後的ctDNA-MRD評估有助於確定誰可以從進一步的治療中獲益。把兩個不同時間點合併的界標分析的臨床相關性是有爭議的，是不恰當的，並且具有誤導性。
2）Guardant Reveal的研究宣稱其特異性為100%，其實是排除了2例檢測呈陽性但沒有復發的患者（假陽性，對應特異性）。文章稱2例沒有復發的患者是因為臨床隨訪都不到一年，但患者TPS1473明顯超過了一年的隨訪，存在欺騙。
其次，“縱向時間點”被定義為患者在其“界標”時間點之後進行後續採血。然而所有沒有復發的縱向陰性患者（n=37）只有一次採血，這使讀者懷疑，如果進行不止一次採血，這些患者是否會有不一樣的檢測預測結果。因此在這種情況下，評估真正的特異性和陽性預測值（PPV）仍然是一個挑戰。
3）最後，在“監測分析”中，作者錯誤的引用了Reinert和他的同事使用的方法。Reinert表示自己作為該文章作者也是本信件的作者，確認從未報道過臨床復發4個月內的監測分析。7 因此，在“監測分析”中排除了7例假陰性患者，人為地將靈敏度從55.6%提高到90.9%。其與signatera的88-93%靈敏度相比，真實靈敏度應為69%（縱向分析）。
Natera敦促讀者在考慮任何ctDNA-MRD檢測的效能時，應將術前檢出率作為陽性對照。在Guardant Health的佇列中，即使排除了新輔助治療的患者，其ctDNA的檢出率仍為45.7%。與界標分析、縱向分析和監測分析報告的55.6%、69.0%和90.9%相比，令人驚訝的低。綜上分析，僅血漿ctDNA-MRD檢測的技術流派可能是有問題的，臨床應用需要進一步驗證其效能。
Guardant Health合作者：你荒謬！
2021年9月，Guardant Health的臨床研究合作者也對該信件進行了回應。8 回應直接指出：“上述《致編輯的信》是由Netera公司參與共同撰寫的，該公司是MRD領域的一家公司，他們這樣合作撰寫存在潛在的商業化關係，而我們的回覆是在沒有任何來自我們研究相關公司（GH）技術評估的情況下撰寫的。”這波操作著實作有點秀。
2021年12月，CCR線上刊發“結直腸癌患者僅血漿ctDNA-MRD檢測-回應”。
Guardant Health的臨床研究合作者表示學術界在評估MRD檢測新方法時，需要就哪些分析和終點達成標準共識。並隨後對Natera及其合作者的信件進行了回懟：
1）關於界標分析（landmark analysis），Guardant Reveal的研究定義為僅接受手術患者術後30天，或接受手術和輔助治療的患者在輔助治療後約30天。事實上，Reinert和他的同事在他們的研究中也使用了“後確定治療”終點作為主要分析，7 並貼上原作者的文章圖片進行硬剛，火藥味十足。
同時，回應也指出：患者是否出現腫瘤復發純粹取決於在最終治療分析時是否存在MRD，重要的是，患者是否受到任何干預治療的潛在影響。如果只利用手術後的時間點，那麼繼續接受輔助治療的患者就不能確定患者是否因術後沒有病灶而沒有復發，或者他們後來是否透過輔助治療治癒了。之前信件的作者Reinert將此終點的使用描述為“不恰當和誤導性的”，但又將此終點作為他們研究的主要分析，是極不負責任的行為。
回應指出“界標”（干預後30天）的靈敏度應該是MRD研究的標準終點，因為手術或其他最終治療完成後的1-2個月是基於MRD檢測作出臨床決策的視窗期——是繼續觀察還是將治療升級或降級。因此，這個時間點預測最終複發率在臨床上是最相關的。這就是為什麼大多數MRD研究集中在30天時間點分析的原因。
2）這封信作者提出的第二個批評實際上是不準確的：患者TPS1473在完成最終治療後僅進行了292天的臨床隨訪，並沒有達到一年。
考慮到Guardant Reveal研究佇列中的患者在最終治療後有不同長度的臨床隨訪，研究者透過兩種方式討論特異性。首先，研究者報告了研究中所有患者的特異性為95.4%。值得注意的是，只有2例（共17例）在最終治療後檢測為ctDNA-MRD陽性，但資料切割後沒有復發（隨訪時間少於1年），因此不能確定這些患者是否代表實際的假陽性，或者這些患者是否會在後續的隨訪中復發。此外，研究者報告的100%特異性是基於在最終治療後進行至少1年臨床隨訪的患者，在文章中也有說明，所以特異性分析是沒有問題的。
3）最後，這封信的作者提出了研究中進行的探索性“監測分析”的問題，該分析是基於Reinert和他的同事的研究方法，他們的比較分析排除了50名沒有監測樣本的患者。7 所以考慮到Guardant Reveal研究佇列中大多數患者缺乏系統、定製的序列繪製，限制了縱向監測進行全面評估的能力，因此這些分析不是次研究的主要重點。
為了接近Reinert和他的同事進行的“監測分析”，Guardant Reveal研究佇列才評估了復發4個月內連續抽血的患者佇列。Reinert和他的同事從他們的“監測分析”中排除了至少7例在總體分析中呈假陰性的患者，所以Guardant Reveal研究佇列也在“監測分析”中排除了這類患者。如果這封信的作者認為這樣做是“人為地提高靈敏度”，那麼這種批評應該首選針對自己的研究，這種方法使他們的ctDNA-MRD界標分析靈敏度從41%提高到了88%。
總的來說，Guardant Health相信ctDNA指導的MRD檢測對癌症治療產生了潛在的革命性影響。Guardant Health研究的目的是對僅血漿ctDNA-MRD檢測可行性的初步評估，而不是支援腫瘤不知情分析（Tumor-uninformed assays）或腫瘤知情分析（Tumor-informed assays）的方法。無論兩種MRD技術流派如何，都應在更大的觀察性或前瞻性佇列中更徹底地評估每種技術方法的效能特徵。
這次雙方的爭論也強調了學術界在評估MRD檢測技術時應對分析和終點達成標準共識的必要性。早前NCI釋出的《結腸和直腸肛門工作組白皮書》強調了手術後或所有治療結束完成後2-8周進行ctDNA-MRD評估的重要性。9 這為ctDNA-MRD這一重要而迅速發展的領域制定標準而繼續作出這種性質的學術努力是非常有價值的。
MRD技術流派之爭仍在繼續。
MRD之路不易，且行且珍惜！
好了，回答下文章開頭的問題：ctDNA-MRD檢測的金標準方法是什麼？
截至目前，最新公開發表的文獻（2021.11）提及的ctDNA-MRD檢測金標準方法是Tumor-informed assays（腫瘤知情分析）的個性化定製，國內採用此技術流派的公司有至本醫療（已研發上市），華大基因（引進Signatera），燃石醫學（技術研發中）等。
參考資料：
1.Parikh Aparna R,Van Seventer Emily E,Siravegna Giulia et al. Minimal Residual Disease Detection using a Plasma-only Circulating Tumor DNA Assay in Patients with Colorectal Cancer.[J] .Clin Cancer Res, 2021, undefined: undefined.
2.https://www.precisiononcologynews.com/liquid-biopsy/guardant-mrd-test-performs-well-small-study-tissue-informed-debate-takes-shape#.YdluO-gzbIU
3.https://investors.guardanthealth.com/press-releases/press-releases/2021/Guardant-Health-Files-Lawsuit-Against-Natera-for-Misleading-Oncologists/default.aspx
4.https://www.natera.com/company/news/natera-responds-to-meritless-lawsuit-and-files-false-advertising-claim-against-guardant-for-misleading-oncologists/
5.https://investors.guardanthealth.com/press-releases/press-releases/2021/CORRECTING-and-REPLACING-Study-Shows-Guardant-Reveal-Blood-Only-Liquid-Biopsy-Test-Predicts-Risk-for-Colorectal-Cancer-Recurrence-with-Industry-Leading-Sensitivity/default.aspx
6.Reinert T, Henriksen TV, Aleshin A, Zimmermann B, Andersen CL. Plasma-only ctDNA-Guided MRD Detection in Patients with CRC-Letter. Clin Cancer Res. 2021 Dec 1;27(23):6613. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-21-2735. PMID: 34853074.
7.Reinert Thomas,Henriksen Tenna Vesterman,Christensen Emil et al. Analysis of Plasma Cell-Free DNA by Ultradeep Sequencing in Patients With Stages I to III Colorectal Cancer.[J] .JAMA Oncol, 2019, 5: 1124-1131.
8.Parikh AR, Corcoran RB. Plasma-only ctDNA-Guided MRD Detection in Patients with CRC-Response. Clin Cancer Res. 2021 Dec 1;27(23):6614-6615. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-21-3306. PMID: 34853075.
9.Dasari A, Morris VK, Allegra CJ, Atreya C, Benson AB III, Boland P, et al. ctDNA applications and integration in colorectal cancer: an NCI colon and rectal-anal task forces whitepaper. Nat Rev Clin Oncol 2020;17:757–70.
