在上一期中，野菜君為大家介紹了組蛋白甲基化和RBP兩種lncRNA機制研究的新切入點，估摸著也都忘得差不多了，不如先來複習一下：
如果腦子一片空白，請回看上一篇：
讓你的lncRNA擺脫miRNA的束縛（上）
這期我們繼續瞭解一種套路：lncRNA與轉錄因子。
PS：本來這一期是要把剩下兩種機制都講完的，但是上期釋出後收到許多的反饋表示內容實在太多了，脆弱的注意力根本遭不住，所以我們貼心地為各位拆成了兩篇來發布。
LncRNA與轉錄因子（transcriptional factor）
本節關鍵詞：HIF-1α， YB1，BX111，ZEB1
本節相關文獻：Hypoxia-induced LncRNA-BX111 promotes metastasis and progression of pancreatic cancer through regulating ZEB1 transcription，oncogene.
轉錄因子（transcription factor）其實是一類大家比較熟悉的蛋白了，其透過結合靶基因啟動子的相關位點，能夠促進基因的表達。本節選取的範例文章發表於2018年的oncogene，同時從轉錄因子對lncRNA的調控以及lncRNA對轉錄因子的調控兩個方面展示了lncRNA與轉錄因子的研究套路，是一篇說明lncRNA與轉錄因子相互作用的非常好的範文。
我們還是先透過下面的機制模式圖，對思路有個大概的瞭解。（TF：轉錄因子）
好了，我們來看看作者具體是怎麼操作的。
首先，作者透過catRAPID這個預測軟體，發現lncRNA 可能與YB1結合（4a）以及轉錄因子YB1在ZEB1這個基因的啟動子區域存在結合位點。然後，透過臨床資料分析，發現YB1與ZEB1（4c）以及BX111與YB1（4d）存在正相關，但BX111與YB1不存在正相關（4e）（注意這裡的D圖作者使用了starbase裡TCGA的資料分析）。接著，還是老兩樣，作者透過RIP和RNA pull down驗證了BX111與YB1的結合（4f，4g，4h），值得注意的是，在h圖中作者也用了三種不同的BX111的片段，來確認結合的具體位置。
在確認了BX111與YB1的結合後，作者先是透過WB驗證了YB1對ZEB1的表達的調控（5a，5b），利用CHIP驗證了YB1在ZEB1啟動子區域的結合（5c），利用雙熒光素酶實驗驗證了YB1對ZEB1的轉錄活性的調控（5d）。接下來透過敲降BX111，利用CHIP實驗發現BX111敲降後，YB1在ZEB1的啟動子區域的結合降低（5e）；最後透過同時敲降BX111與過表達YB1，驗證了BX111對ZEB1的調控依賴於YB1（5f，5g，5h）。至此，作者驗證了BX111-YB1-ZEB1這一功能軸。
是不是覺得有點眼熟呢，對，我們可以把這裡的轉錄因子類比成EZH2，只是前者是促進基因的轉錄，後者是抑制基因的轉錄，但是中間用到的方法和設計的邏輯，都是非常類似的。PS：在這裡也忍住不想誇讚一句，本文的作者，對於分組，以及實驗的安排都十分的詳盡和合理，非常具有借鑑意義。
作者做完了上面一套完整的機制，似乎還有點意猶未盡的感覺，靈機一動，在BX111上游找到了一個轉錄因子，也就是大名鼎鼎的缺氧誘導因子HIF-1α。如下圖6a所示，在BX111的啟動子區域存在與HIF-1α結合的片段。同時，在缺氧刺激的情況下（hypoxia以及CoCl造模），BX111以及HIF-1α均存在上升的趨勢（6b）。
而透過qPCR以及FISH檢測，作者證實了HIF-1α的沉默能夠降低BX111的表達（6c，6d）。最後，透過CHIP實驗，作者驗證了缺氧能夠誘導HIF-1α以及Pol II在BX111的啟動子區域結合增多（6e，6f）；透過雙熒光素酶實驗，驗證了缺氧能夠升高BX111的轉錄活性，而這些結果均能夠被HIF-1α的敲降所抑制（6g）。
至此，透過又一套完整的設計，作者得出了缺氧誘導的HIF-1α能夠促進BX111的轉錄的結論。
結合上半部分的結果，我們可以跟著下面所展示的作者繪製的機制圖，再梳理一遍lncRNA與轉錄因子的套路：
如果要做轉錄因子在lncRNA上游，找到一個可以與lncRNA啟動子區域結合的轉錄因子，透過CHIP驗證其兩者的結合，透過雙熒光素酶實驗驗證轉錄調控，qPCR驗證轉錄因子對lncRNA表達的調控。
如果要做轉錄因子在lncRNA下游，先透過預測找到一個可以與lncRNA本身結合的轉錄因子，透過RIP和RNA pull down證實其結合，透過WB，qPCR, CHIP，雙熒光素酶實驗證實lncRNA對轉錄因子對下游靶基因表達的調控。
關於lncRNA與轉錄因子的技術總結
1. LncRNA可以受轉錄因子的調控，也可以調控轉錄因子的功能，這兩種功能可以單獨成文，也可以串起來增加文章的丰度。
2. 由於腫瘤的缺氧特性，HIF-1α是最常用作lncRNA的上游調控的轉錄因子，除了HIF-1α外，還有SP1, P53，也常有文獻報道。
3. 上述這篇文獻的實驗設計很精緻，可以作為此套路的範例參考。
