免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。
免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由於抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合後，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。
直接法
將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多餘熒光抗體，室溫下乾燥後封片、鏡檢。
間接法
如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗體—抗原—抗體複合物，再用水洗去未反應的標記抗體，乾燥、封片後鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
基本實驗步驟及注意事項：
1、吸棄培養基，用PBS洗滌細胞2次，每次1 min，期間，輕輕晃動小皿3-5次；
注意: 小孔中培養基不用特意吸棄乾淨，以免處理過程中損失太多的細胞。
2、棄盡小皿和小孔中的PBS後，加入1 ml 4%的多聚甲醛固定液(由pH 7.4的PBS配製)固定細胞10 min，棄多聚甲醛固定液，用PBS洗滌細胞兩次，每次1 min；
注意: 4%多聚甲醛有效期為2-3個月，注意及時更換溶液，以免影響固定的效果。
3、棄盡小皿和小孔中的PBS後，加入由PBS配製的0.2%的Trion X-100通透8-15 min (由細胞的疏密決定)，PBS洗滌細胞兩次，每次1 min；
注意: 通透時間不能超過15 min。
4、使用由PBS配製的3%的BSA封閉Sf9細胞30 min；
5、用3%的BSA的稀釋抗體，最終體積100-200 μl，抗體稀釋比例以抗體的靈敏度決定，一般稀釋比為1:100-500之間。棄盡小皿和圓孔中的封閉液，加入抗體免疫標記1-2 h；
注意: 抗體的稀釋濃度，需要根據抗體的靈敏度來決定。當不清楚抗體的靈敏度時，可以1:200進行嘗試，後期再最佳化抗體的濃度。在進行免疫雙標的過程中，若兩個蛋白的表達量不一致，尤其是其中一個表達量較低難檢測時候，需要選擇靈敏的一抗和二抗。
6、用PBS洗滌細胞兩次，每次10 min。
7、棄盡圓孔中PBS後，按照1:200-500的比例，用3%的BSA稀釋偶聯了熒光素的二抗，終體積200 μl，避光孵育Sf9細胞60 min；
注意: 二抗的稀釋比例，依然根據其靈敏度來決定。當不清楚抗體的靈敏度時，可以1:300進行嘗試，後期再最佳化抗體的濃度。
8、用PBS洗滌細胞兩次，每次10 min；
9、用鐳射共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5進行觀察、拍照。
end
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