今天推送的文章發表在ACS Catalysis的“Unlocking Asymmetric Michael Additions in an Archetypical Class I Aldolase by Directed Evolution”，通訊作者為格羅寧根大學格羅寧根藥學研究所化學和藥物生物學系的Gerrit J. Poelarends教授。
G.J. Poelarends 組旨在發現和設計用於生產藥物相關產品的新型生物催化劑和生物合成途徑。一個研究領域是開發新的生物催化劑和多酶級聯反應，以有效地不對稱合成具有重要生物學特性的非經典氨基酸。另一個研究領域是開發用於氧化、還原、水合、Michael加成、加氫胺化和羥醛加成反應的對映選擇性生物催化劑，作為廣泛有用的合成鍵形成方法，用於生產藥物和精細化學品。
自然界中的醛縮酶是一種強大的工具酶，可以可逆地催化醛縮酶反應，為不對稱碳的合成提供了一種有效的碳−碳鍵組裝策略。醛醇反應通常利用可烯醇化的醛或酮作為親核供體底物（醛醇供體），與作為親電子受體（醛醇受體）的第二個醛或酮進行反應。進化產生了兩種不同機制的醛縮酶，每種都有一個包含活性位點的磷酸丙糖異構酶（TIM）桶狀摺疊。I 類醛縮酶利用高度保守的賴氨酸 ε-氨基透過共價形成Schiff鹼來啟用醛醇供體，然後生成高度親核的烯胺物質。相反，在 II 類醛縮酶中，金屬離子輔因子（通常為 Zn2+）作為Lewis酸並透過與羰基的配位啟用醛醇供體促進去質子化和烯醇化物的形成。真核生物、細菌和古生菌中的醛縮酶，能促進重要代謝途徑中各種碳水化合物、氨基酸和酮酸的可逆形成或裂解。
典型的I類醛縮酶2-脫氧-D-核糖-5磷酸醛縮酶（DERA）催化乙醛（醛醇供體）和D-甘油醛-3-磷酸（醛醇受體）之間的可逆醛醇加成反應生成2-脫氧-Dribose-5-磷酸（方案1a）。在該反應中，Lys-167 作為DERA活性位點中保守的Schiff鹼形成殘基。儘管DERA接受一些小分子醛和酮，如丙醛、丙酮和氟丙酮作為醛醇供體，但該酶有限的親核範圍限制了其更廣泛的應用。此外，DERA 對非磷酸化醛醇受體的催化效率很低，並且在工業生產的乙醛濃度下酶失活，進一步限制了 DERA 的應用。在過去，其中一些限制已經被蛋白質工程或新發現的蛋白質所克服，並且DERA在手性β-羥基羰基化合物的生物催化合成中有著廣泛的應用，但是對於DERA的開發仍然有限。
在本研究中，作者成功重新設計了大腸桿菌的DERA，以有效催化硝基甲烷與α，β-不飽和醛的不對稱Michael加成反應，生成對映體純的γ-硝基醛，這是活性藥物γ-氨基丁酸的重要手性合成反應。經過11輪定向進化後，重新設計的DERA酶（命名為DERA-MA）攜帶12個氨基酸替換突變，與野生型酶相比，催化活性顯著提高190倍。DERA-MA在無底物和底物結合狀態下的高解析度晶體結構揭示了一些突變如何重塑活性部位的底物結合口袋，以容納α，β-不飽和醛並將其導向催化賴氨酸，從而形成共價Schiff鹼中間體。這些結果證明定向進化擴大了原型I類醛縮酶的反應範圍，包括不對稱Michael加成，併為開發一系列新型DERA衍生催化劑，為幾種結構性的碳連線提供了新的機會。
鑑定DERA催化的新型碳連線反應
大腸桿菌的 DERA 已被廣泛用於學術界和工業界開發的生物催化過程中的醛醇加成，但這種酶是否可以用於促進Michael加成反應仍不清楚。考慮到DERA的活性部位可以容納各種醛，作者首先測試了DERA是否可以作為催化劑用於不對稱合成有價值的γ-硝基醛。這些用於大量處方藥物的重要手性合成子可以透過乙醛與α，β-不飽和硝基烯烴的Michael式加成或硝基甲烷與α，β-不飽和醛的Michael式加成來製備。測試結果表明，DERA不能夠催化天然供體底物乙醛（50和150 mM）與非天然受體底物反式硝基苯乙烯（2 mM）進行Michael加成，但DERA對硝基甲烷2與肉桂醛1a的Michael加成反應（方案1b）表現出催化活性，GC−MS分析表明，在30小時後以38%的轉化率生成γ-硝基醛3a，且具有良好的對映體純度（e.r.=96:4）。而在其他反應條件相同時，不使用 DERA 或使用突變體 DERA K167L（其中活性位點 Lys-167 已被Leu替換）的反應僅提供痕量的產物 3a。因此，DERA利用 Lys-167 作為關鍵催化殘基促進底物2 到 1a 的Michael加成，得到對映體富集的R-3a，儘管活性較低。
DERA的定向進化
受這些發現的啟發，作者開發了一種有效的定向進化策略，用於最佳化DERA催化2到1a的Michael加成反應。首先，在定向進化活動的第一輪中使用了易錯PCR得到隨機的DERA序列空間有益突變的樣本文庫，並使用稱為活化亞胺菌落染色 (AICS) 的預篩選試驗分析所得文庫（~75,000 個細菌菌落）中的DERA 突變體活性。經過篩選後回收 DERA 突變體，進行 UV-vis 活性測定，結果顯示這些突變體對2 至 1a的Michael加成的活性顯著提高，最高活性比 DERA-wt 提高了9.5 倍。
作者隨後透過結合具有有益突變的DERA變體的基因改組、活性位點殘基的位點飽和突變和使用易錯PCR隨機突變來最佳化DERA的這種非自然活性。經過11輪定向進化後，獲得了一種DERA突變體（命名為DERA-MA），與DERA-wt相比，其催化活性顯著提高了190倍(圖1)。該DERA突變體包含12個氨基酸替換突變，其中8個透過使用易出錯PCR的隨機突變（T18S、D22G、D24Y、C47S、F52S、T197S、A203T和S239G）引入，2個透過加標寡核苷酸（K172L和V206A）的盒式突變引入，2個透過位點飽和突變（P202V和T142S）引入。同時，在整個進化過程中，DERA的對映選擇性也得到了提高，能夠以99:1（R/S）的e.r.比例生產 3a。
DERA-MA的特徵
基於定向進化最佳化的DERA-MA催化2至1a的Michael加成反應的動力學引數為 kcat(kcat,app) 0.38 ± 0.01 s−1，KM,app302 ± 14μM (kcat,app/KM,app= 1258 s−1M−1)。DERAMA的催化活性比課題組先前設計的4-草醯膽酸互變異構酶（4-OT）突變體高100倍，DERA的TIM-barrel褶皺結構被證明對酶最佳化更敏感。另外，DERA-MA失去了對天然底物 2-脫氧-D-核糖-5-磷酸的原始醛縮酶活性，表明新獲得的Michael加成的催化功能是以犧牲原始活性為代價的。
用Leu（DERA-MA K167L）替換Lys-167可使催化活性降低150倍以上，表明Lys-167對DERA-MA的Michael加成活性至關重要（圖S5）。這表明Lys-167在DERA-MA催化2至1a的Michael加成反應中保留了形成Schiff鹼殘基的重要催化功能。使用NaBH3CN對DERA-MA進行還原後，ESI-MS分析顯示，與未修飾的DERA-MA相比，觀察到的主峰增加了117 Da，對應於蛋白質與1個分子的還原Schiff鹼加合物1a的共價修飾（計算28760.8DA；發現28761.0DA）。為了進一步瞭解修飾的位置，用內蛋白酶Glu-C消化修飾過的和未修飾的DERA-MA樣品，透過LC−MS/MS對所得肽混合物進行分析，發現含有Lys-167殘基的肽是主要的修飾位點。
與野生型酶相比，進化的DERA-MA變體包含12個氨基酸替換。為了每個新氨基酸殘基對DERA-MA Michael加成活性的貢獻，我們構建了12種酶突變體，其中DERA-MA中的每個殘基依次被野生型酶中相應的氨基酸取代。其中兩個反向突變（S47C和T203A）導致DERAMA活性降低四倍以上（圖S5）。此外，八個反向突變對DERA-MA活性的影響稍低，但仍然顯著，而兩個反向突變（G22D和S197T）對活性沒有影響。總的來說，這表明DERA-MA中的大多數氨基酸替換（12箇中的10個）主要透過隨機突變方法引入，有利於最佳化酶的非天然Michael加成活性。
DERA-MA的結構分析
DERA-MA 的整體結構（圖2）與野生型 DERA 幾乎相同（Cα-骨架原子的均方根偏差為~0.8 Å），顯示典型的 (α/β)8(TIM-桶) 摺疊，催化 Lys-167 位於鏈β6 的 C 末端。催化賴氨酸與保守的Lys-201（β7鏈）和Asp-102（β4鏈）的側鏈非常接近，這兩個殘基在DERA的天然催化機制中起著關鍵作用。12 個突變中共有 10 個位於圍繞活性位點區域的 TIM 桶 C 端側的 5 個鏈螺旋連線環中（圖 2a）。這些突變分別是β1-α2中的T18S、D22G和D24Y，β2α3中的C47S和F52S，β6-α7中的K172L，β7-α8中的P202V、A203T和V206A，以及β8-α9中的S239G。β1-α2和β7-α8兩個環，每個環都包含三個突變，與野生型結構相比，主幹構象發生了顯著變化（圖2a，b）。在DERA-wt結構中，Cys-47與β1-α2環中Leu-20的側鏈形成疏水接觸。在 DERA-MA 結構中，後者殘基已從活性位點區域拉出，打開了由 Tyr-49、Val-73 和 Phe-76 側鏈排列的疏水口袋。在透過用肉桂醛浸泡 DERA-MA 晶體獲得的結構中，作者發現連線到 Lys-167 側鏈的額外電子密度，與共價Schiff鹼中間體的形成一致（圖 2c）。額外的電子密度表明與Lys-167 連線的肉桂基部分的結合模式，它與疏水袋中的苯環牢固結合，而在 DERA-wt 中被 Leu-20 佔據（圖 2d）。
DERA-MA的底物範圍
使用最佳化的酶 DERA-MA，作者評估了其對各種 α,β-不飽和醛 1a-k和α,β-不飽和酮 1l 進行Michael加成的合成效能（表 1a）。除了 1a 之外，DERA-MA 很容易接受在鄰位、間位或對位具有吸電子取代基的醛 1b-作為非天然底物。在鄰位、間位或對位對給電子取代的空間要求更高的醛 1e-g 同樣被接受作為底物，儘管催化活性和立體選擇性略有下降。對位取代的醛 1h-j 也能被 DERA-MA 有效催化。酶產物 3a-j 轉化率良好 (>95%)，對所需的R-對映異構體具有良好的對映純度 (e.r. = 86:14-99:1)。因此，DERA-MA顯示了廣泛的底物範圍。DERA-MA也接受脂肪族不飽和醛1K作為非天然底物，但與芳香族α，β-不飽和醛1a−J相比，其轉化率適中，立體選擇性降低。最佳化的酶不接受α，β-不飽和酮1l作為底物，說明DERA-MA偏好α，β-不飽和醛作為底物。最後，透過對選定的γ-硝基醛（R-3a，d，h）進行半製備規模的合成，作者進一步證明了DERA-MA的合成用途，並獲得了高轉化率（89%至>99%）、優異的對映體純度（e.r.=99:1）和良好的分離產物產率（高達66%）（表1b）。其中，R-3a，d是有價值的具有醫藥活性分子的合成前體。
整理：樑子琦
DOI：10.1021/acscatal.1c03911
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https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c03911
