iPS細胞是什麼？
iPS 是指體細胞經過匯入特定的重程式設計因子而誘導為多能幹細胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）。2006年，日本科學家 Yamanaka 及其研究小組首次選用逆轉錄病毒作為載體，向鼠成纖維細胞中匯入了與多功能性有關的基因（Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4），之後選擇多能性標誌物 Fbx15 篩選轉染後的細胞，最終獲得了具有與胚胎幹細胞（ES）某些特性的多功能幹細胞，並命名為誘導多能幹細胞（iPS 細胞），此細胞在形態、基因和蛋白表達、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等都與胚胎幹細胞極為相似。次年，該研究小組又成功將人體細胞重程式設計為 iPS 細胞，自此，在全球範圍內拉開了 iPS 細胞研究的序幕。與 ES 細胞相比，iPS 細胞的產生解決了幾個重大問題。首先，倫理學專家認為幹細胞的產生不應該破壞任何一個胚胎，而 iPS 細胞繞過了這個倫理學問題；其次，iPS 細胞可以由患者個體的成體細胞重程式設計得來，為個體化的疾病細胞模型提供了有力的基礎；最後，由 iPS 細胞誘導分化而來的成體細胞，可以應用於患者疾病的臨床治療，為再生醫學提供一個嶄新的思路。
iPS細胞如何誘導？
科學家最早用逆轉錄病毒，將多能基因 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 匯入細胞獲得 iPS細胞，此方法有外源基因插入的風險，後續有科學家用腺病毒，質粒轉染法，合成 RNAs和蛋白質等無外源基因整合風險的方法將多能基因匯入細胞獲得 iPS 細胞。iPS 重程式設計過程中，多能基因的選擇至關重要，目前已知的候選基因有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、Lin-28等，但是在研究中有研究者發現，除了 Oct4 外其他的基因都可被其他轉錄因子所代替，因此這也間接證明了 Oct4 是誘導形成 iPS 細胞的必需基因。利用多能基因方法效率都極低，相對而言，最高的是有外源基因插入風險的逆轉錄病毒載體法。因此，科學家們不斷探索更安全更高誘導效率的方法。有研究者發現，在誘導過程中加入丙戊酸 VPA，維生素 C，SV40 大T抗原，強力黴素等小分子能提高誘導效率。目前在實驗室應用最多的是質粒和仙台病毒，在再生醫學方面應用最多的是附加型質粒，在體外研究應用最多的是逆轉錄病毒和質粒。
iPS細胞如何進行基因敲除？
誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs) 是指透過匯入特定的轉錄因子將終末分化的體細胞重程式設計為多能性幹細胞，具備多向分化潛能和自我更新能力，而且IPS細胞也保留了細胞來源個體的遺傳背景。透過CRISPR/Cas9基因編輯技術，構建基因敲除、點突變和敲入IPS細胞，可為多種疾病的發生和治療提供有效的研究模型。
iPS細胞基因敲除實驗流程
iPS細胞基因編輯有哪些應用範圍？
· CISH-/- iPSC-NK細胞提高抗腫瘤活性
研究人員將供體的面板或血細胞重程式設計為誘導多能幹細胞（iPSC），然後再定向分化為NK細胞（iPSC-NK細胞），在iPSC-NK細胞中利用CRISPR/Cas9技術將CISH基因敲除，該基因調控含SH2蛋白的表達（CIS；CISH的蛋白產物），CIS是訊號傳導的關鍵負調控因子。研究結果表明，CISH-/- iPSC-NK細胞在白血病異種移植模型中，敲除後的NK細胞增強了對腫瘤生長的抑制，而且敲除後的NK細胞在體內的永續性也顯著增加了。CISH的缺失增強了NK細胞的功能，CIS透過調節人類 NK細胞代謝活性從而在抗腫瘤活性方面起著關鍵作用。
圖1. 從人類iPSC中構建CISH-/- iPSC-NK細胞
· iPSC技術用於ASD發病機制研究
自閉症譜系障礙 （ASD） 是一種複雜性的神經發育障礙性疾病，在表型和遺傳上具有異質性。研究人員透過插入蛋白質標籤和提前終止密碼子，為iPSC細胞系中10個功能不同的ASD風險基因設計了完全敲除的基因編輯策略（AFF2/FMR2, ANOS1, ASTN2, ATRX, CACNA1C, CHD8, DLGAP2, KCNQ2, SCN2A, TENM1），且所有突變都在相同的“等基因”（遺傳背景相同）中產生，以此研究ASD風險基因的基因功能。將KO iPSC細胞誘導分化為興奮性神經元，採用RNA測序對誘導分化神經元的轉錄特性進行研究，揭示了幾個神經元網路的融合。同時使用膜片鉗和多電極陣列方法，發現不同突變的電生理缺陷是不同的，但它們最終會導致突觸活動持續減少。儘管ASD易感基因屬於不同的基因本體，但等基因的幹細胞可以揭示常見的功能表型，例如神經元連線功能降低。鑑於ASD的異質性，這類基於CRISPR等基因的敲除系統可能對逐步控制的細胞表型實驗是必不可少的。
圖2. iPSC細胞的KO與相關基因檢測
· 在iPSC衍生的人類類器官疾病模型中研究miRs失調的病理途徑
microRNA （miRs） 是一類非編碼小RNA，它們在發育和生理背景下具有重要的調節作用。Kung等在人類iPSC細胞中敲除了miR-26b莖環基因，以探索miR-26b在發育和疾病中的作用。該基因編輯的細胞系表現出正常的核型，表達多能性標記並分化為三個胚層的細胞。這為研究發育提供了一個良好的實驗模型，並闡明瞭iPSC衍生的人類類器官疾病模型中miR-26b下游調節異常的病理途徑。
圖3. iPSC細胞中miR-26b的敲除與鑑定
· F9基因敲入的iPSC細胞用於血友病治療
目前對血友病的標準治療方案是細胞替代療法，雖然有效，但存在一定的病毒感染的風險，而且需要終身治療，只有基因療法才有可能從根本上治癒血友病。從患者的外周血單核細胞 （PBMC）中誘導，形成iPSC細胞，構建了靶向AAVS1靶點的AAVS1-Cas9-sgRNA和AAVS1-EF1α-F9 cDNA-嘌呤黴素donor，並將它們透過電轉匯入iPSC中，成功地將人全長F9 cDNA敲入iPSCs的AAVS1位點。然後將 iPSC分化為肝細胞，發現該肝細胞可以穩定分泌人凝血因子IX （hFIX），並能夠在短期內移植到非肥胖糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷病（NOD/SCID）小鼠中，這為血友病的臨床基因治療提供了一種新方法。
圖4. F9 cDNA插入HB iPSCs AAVS1位點
· iPSC細胞的雙敲除技術揭示細胞凋亡機制
已有研究表明，BAX和BAK在小鼠胚胎生長過程中都是必不可少的，並且在人類癌細胞系中證實了BAX和BAK在細胞凋亡過程中線粒體裂變中的作用。但是由於缺乏合適的研究模型，BAX和BAK在人類大腦發育中的功能仍然難以捉摸。Joshi等在人誘導多能幹細胞 （hiPSCs）、hiPSC衍生的神經祖細胞 （hNPCs）、神經玫瑰花結和大腦類器官中雙敲除BAX/BAK基因，用來揭示BAX和BAK缺失在體外模型中的對人類大腦早期發育的影響。發現BAX和BAK缺陷細胞具有異常的線粒體形態並導致皮質結構異常。由此認為BAX和BAK在人類發育過程中的關鍵功能，包括維持線粒體形態的穩態，這對於皮質祖細胞和神經元的正常發育至關重要。
圖5. BAX/BAK DKO hiPSCs細胞死亡表型的表徵和驗證
看完以上的案例解析，大家對IPSC實驗設計是否已經有了靈感，躍躍欲試了呢？然而IPSC基因編輯細胞的構建是個耗時的過程，特別是單克隆細胞的篩選，費事費力；而且想要最終拿到基因編輯效果徹底的IPS細胞並不容易，例如在構建的過程中，細胞培養條件的稍不注意便可能導致IPS細胞的分化。
參考文獻
[1] Zhu, Huang et al. “Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity.” Cell stem cell . 27,2 （2020）: 224-237.e6.
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[3] Kung, Louise H W et al. “Generation of a miR-26b stem-loop knockout human iPSC line, MCRIi019-A-1, using CRISPR/Cas9 editing.” Stem cell research. 50 102118. 10 Dec. 2020.
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作者：海星生物
公眾號：Cas9X細胞基因編輯
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