編者按：糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見的慢性併發症之一，嚴重影響患者的生活質量和預後。然而，目前針對DR的有效治療手段仍然有限，因此探討其發病機制以尋找更好治療靶點以及防控策略成為糖尿病研究領域的重要課題之一。近日召開的第57屆歐洲糖尿病研究協會年會（EASD2021）專門設定了“認識DR”專題（OP 06），6項最新研究結果在此公佈，本刊特邀哈爾濱醫科大學附屬第一醫院匡洪宇教授對此介紹並予以精彩點評。
OP 06-31:使用SDRNT1BIO佇列評估黃斑病變深度學習預測模型
背景和目的：DR和黃斑病變是糖尿病患者致盲的主要原因。目前，包括蘇格蘭在內的許多國家都有便於早期發現的基於眼底照相的篩查方案。在蘇格蘭，許多疑似黃斑病變患者從篩查專案轉診至專科醫生診治，但隨後返回篩查專案中，這表明黃斑病變未得到專家確認。透過眼底照相準確預測黃斑病變，可減少人們不必要的就醫。本研究旨在確定使用視網膜影象的深度學習預測模型能否預測蘇格蘭DR篩查專案中疑似黃斑病變被轉診至專科診治且未返回篩查專案的患者。
材料和方法：研究人員訓練了一個RegNetY016網路來預測糖尿病黃斑水腫（DME），資料來自DR臨床研究網路以及Kaggle-EyePACS和Messidor資料集，使用了25 557張眼底影象。研究人員對本研究中的RegNetY016模型以及公眾可用的DeepSeeNet和ARIANNA年齡相關性黃斑變性預測模型進行了評估。評估資料包含68 488張眼底影象（886張被轉診且未返回），這些影象來自蘇格蘭1型糖尿病（T1DM）生物資源中2005~2017年參加蘇格蘭國家篩查專案的5539例受試者。評價結局定義為影象被分級為可轉診且相應患者未返回篩查專案。評估排除2年內拍攝的最新影象和患者死亡前2年內拍攝的影象。
結果：RegNetY016模型識別的疑似黃斑病變影象且相應患者未返回篩查專案的AUC曲線下面積（AUROC）為0.85。DeepSeeNet預測模型識別這一結局的AUROC為0.75，而ARIANNA模型僅為0.60。
結論：深度學習預測模型能夠根據眼底影象識別蘇格蘭篩查專案中因黃斑病變而被轉診治療且後續未返回篩查專案的患者。這表明，深度學習模型可能是一個有效工具，以幫助減少不必要的黃斑病專家預約。
OP 06-32:全外顯子組和全基因組測序揭示T1DM嚴重DR的新罕見遺傳變異
背景和目的：遺傳因素在DR的易感性中發揮作用，但旨在識別DR相關遺傳因素的研究仍很少。本研究的目的是在芬蘭糖尿病腎病（FinnDiane）研究中，透過全外顯子組測序（WES）和全基因組測序（WGS）研究，發現T1DM中與嚴重DR（SDR）相關的罕見變異。
材料和方法：研究人員分別對大約600例和500例T1DM患者進行了WGS和WES。WES在Illumina HiSeq2000上完成，WGS在Illumina HiSeq X平臺上完成，至少覆蓋30倍，兩者均與GRCh38參考基因組進行比對。SDR表型基於主治醫生、醫療記錄和截至2017年底的芬蘭醫院出院登記處提供的資料。SDR定義為出現首次鐳射光凝治療事件或增殖性DR診斷。對照組至少20年無SDR。經過表型確定和質量控制，研究群體包括490例患者WES（390例）和583例患者WGS（405例）。對於WES和WGS的外顯子區域，透過評分檢驗和METAL薈萃分析進行相關性檢驗；對於其他區域，用WGS的Firth迴歸檢驗相關性。利用WES和WGS對具有兩個小等位基因頻率閾值（5%和1%）的蛋白改變或截短變異進行SKAT-O基因聚合試驗，以提高檢測低頻率和罕見變異關聯的能力。分析中的協變數包括性別、發病年齡和測序資料集主成分1和2。
結果：單標誌物薈萃分析顯示，SDR有6個變異P<10-5，其中與LDB3上的同義變異rs372789789（MAF=0.2%，P=4.6×10-7）和PASK上的同義變異rs56043607（MAF=0.6%，P=8.2×10-7）的相關性最強。在外顯子外，SDR的11個位點變異P<10-5，其中與1個基因間變異rs9940767的相關性最強（MAF=22%，P=5.7×10-7）。在WGS中蛋白截短變異負擔最強（MAF<5%和MAF<1%）的基因為UACA（SKAT-O P=9.6×10-4），在WES中亦如此（P=0.02）。UACA是一種具有螺旋結構域和錨蛋白重複的葡萄膜自身抗原，與全葡萄膜炎有關。在既往發現與SDR相關的CACNB2基因上，研究人員發現1個與SDR相關的內含子變異（rs4747341，WGS P=8×10-4）。WGS未發現與CACNB2基因聚合試驗相關的訊號，但CACNA1C的蛋白改變變異與SDR相關（MAF<1%，SKAT-O P=0.001），而CACNA1C與CACNB均為同一鈣通道的一部分。
結論：WES和WGS的資料表明，UACA中罕見的蛋白截短變異與T1DM患者的SDR風險有關。透過對CACNB2基因的查詢，研究人員發現CACNB2基因上的內含子變異與CACNA1C基因上的蛋白改變變異相關，二者均為同一鈣通道的一部分。
OP 06-33:繪製糖尿病視網膜每日節律轉錄組
背景和目的：眼睛是一種有節律的器官，透過功能性生物鐘專門進化出圍繞光週期發揮作用的功能。據報道，糖尿病等疾病會破壞生物鐘，而生物鐘破壞成為影響疾病預後和治療成功的重要因素。研究人員繪製了小鼠視網膜節律轉錄組，以瞭解糖尿病導致的生物鐘破壞程度。
材料和方法：健康對照小鼠和Ins2Akita/J糖尿病小鼠在生理性12h:12h光暗週期下飼養至4月齡。在晝夜週期前後每4小時採集一次視網膜，進行深度mRNA測序。計算方法用於檢測節律性（經驗性JTK_CYCLE，P<0.05，fc>1.25）、峰值預測（諧波迴歸分析）、差異節律模式（DORD，P<0.05）、相集富集分析（P<0.05）和上游調控因子預測。在人視網膜內皮細胞的體外實驗中進行驗證。
結果：近10%的視網膜轉錄組被鑑定為有節律，具有明顯的12小時轉錄活性軸，在中午和午夜達到峰值。儘管12小時轉錄軸保留在糖尿病視網膜中，但它大約提前了1~3小時。與對照組相比，共有478個基因在糖尿病中被鑑定為有節律性差異的基因。相移基因（405個轉錄本）多於振幅改變基因（154個轉錄本）。
糖尿病沒有改變生物鐘的相位。但相集富集分析顯示，氧化磷酸化在糖尿病視網膜中提前近4小時。那時糖尿病小鼠血液中的葡萄糖水平達到峰值，可能驅動了視網膜中的代謝變化。下游分析確定氧感知機制和HIF1A是相移的主要上游調節因子。
結論：這是首次研究糖尿病對視網膜節律輸出的影響。重要的是，我們已經開始剖析糖尿病視網膜中這種節律破壞的來源，並發現在糖尿病視網膜中生物鐘被保留下來，但代謝紊亂改變了視網膜中的一組基因，這可能導致組織內部的時差反應。
OP 06-34:甲基乙二醛對人視網膜內皮細胞的轉錄和轉錄後影響：DR的新成員？
背景和目的：甲基乙二醛（MGO）是糖酵解的一種高反應性副產物，在糖尿病患者體內累積會對血管功能不利。MGO介導高糖誘導的大血管內皮細胞改變，但對人視網膜內皮細胞（hRECs）的影響尚未闡明。本研究評估了MGO在hRECs中的功能和分子效應，確定了DR內皮損傷的調控網路。
材料和方法：將市售原代hRECs暴露於500μM MGO 72小時進行功能測定（MTT、細胞遷移和成管）。轉錄組和miRNA組（miRNome）分析分別採用RNA-Seq（約60M雙端測序讀數/樣本）和小RNA-Seq（10M單端測序讀數/樣本）。採用TopHat、RNA-SeqGUI和iSMART進行製圖和資料歸一化。差異表達（DE）基因的生物程序/通路（edgeR工具，FDR≤0.05）和miRNAs（NOISeq工具，Prob≥0.9）透過開源資料庫/工具（KEGG、DAVID、Panther、miRPathDB、Reactome）進行鑑定。使用ENCODE ChIP-Seq工具和miRPathDB來選擇DE基因中具有豐富結合位點的轉錄調控因子（TRs）和miRNAs。透過STRING和miRnet分析蛋白-蛋白和miRNA-基因的相互作用。
結果：MGO顯著損害hRECs的細胞遷移和成管能力（P≤0.05），並誘導涉及基因表達調控（454個基因）、細胞週期（108個基因）、細胞增殖（104個基因）、細胞死亡（95個基因）、細胞粘附（79個基因）和血管形成（44個基因）的廣泛基因轉錄干擾。神經元限制性沉默因子（NRSF/REST）是在約60%（1009個基因）的DE基因中具有豐富結合位點（Q≤0.05）的TRs之一。根據ENCODE ChiPSeq資料，NRSF/REST被預測能夠調控涉及基因表達調控（約70%）、細胞週期（約78%）和細胞死亡（約74%）的大多數DE基因，表明其是MGO誘導hRECs失調的一個可靠中介物。值得注意的是，受限相互作用網路表明，NRSF/REST作為樞紐，連線多個已知在視網膜生成（如Hipk、Ngfr）、視網膜神經元細胞（如Jun、FosL2、Hes1）和/或DR（如p53、Vegfa、Sirt1）中起作用的失調因子。此外，分析顯示，MGO導致83個miRNAs失調，並靶向大約75%的DE基因（1354個基因）。值得注意的是，參與NRSF/REST限制網路的上調因子是23個下調miRNAs的靶點。因此，研究人員重建了一個失調mRNA-miRNA相互作用網路，可能介導了MGO誘導的hRECs轉錄和轉錄後干擾。
結論：本研究揭示了MGO誘導hRECs的功能和分子效應，其代表了DR中主要事件的假定中介。MGO直接誘導視網膜內皮細胞的轉錄和轉錄後改變。NRSF/REST、其他關鍵蛋白編碼基因改變和miRNAs失調之間的相互作用網路可能維持這些效應。針對候選mRNAs/miRNAs能否抑制MGO對hRECs的有害影響的實驗分析正在進行，將揭示視網膜微血管細胞中糖毒性的分子介質。
OP 06-35:兒童T1DM患者視網膜神經退行性變兩年進展：血糖變異性的作用
背景和目的：視網膜神經退行性變（RN）被認為是DR的早期標誌物，先於血管損傷出現。在T1DM兒童中，關於血糖控制和每日血糖變異性（GV）對早期RN的影響和預測作用的資料很少。本研究旨在無任何併發症的T1DM兒童中，評估兩年內視網膜神經結構改變以及GV對RN的預測作用。
材料和方法：入選25例採用持續葡萄糖監測（CGM）和持續皮下胰島素輸注且無任何併發症的T1DM患者（年齡10~20歲）以及18例年齡與性別相近的健康對照者，隨訪2年。所有受試者接受海德堡光譜光學相干斷層掃描，分析所有黃斑神經視網膜層，測量中心凹下、內外象限的平均值。計算T1DM患者的HbA1c、GV和標準化CGM指標。收集基線、12個月和24個月時的資料。
結果：與對照組相比，T1DM患者基線時視網膜神經纖維層（RNFL）內段厚度明顯變小（91.8±6.9 μm vs. 96.5±5.6 μm，P=0.02）；12個月和24個月時視網膜外網層（OPL）的內象限（12個月：152.8±9.4 μm vs. 163.9±12.8 μm，P<0.01；24個月：150.3±9.5 μm vs. 163.5±12.8 μm，P<0.01）和整個象限（12個月：257.1±12.6 μm vs. 286.4±66.5 μm，P=0.05；24個月：254.3±10.2 μm vs. 289.6±67.6 μm，P=0.05）均明顯變薄；24個月時視網膜內層厚度（IRT）明顯更薄（1201.3±40.5 μm vs. 1244.1±61.6 μm，P=0.04）。
T1DM患者在隨訪2年後，OPL和IRT呈進行性下降（P<0.05）。在T1DM患者中，基線時連續重疊淨血糖作用（CONGA-1h）和RNFL內段呈負相關（r=-0.42，P=0.05）；24個月時平均絕對葡萄糖（MAG）和OPL內象限呈負相關（r=-0.53，P=0.04）；IRT δ厚度（24個月-12個月）與血糖不穩定指數（r=-0.64，P=0.01）、MAG（r=-0.61，P=0.02）呈負相關。HbA1c與黃斑層厚度無顯著相關性（P>0.05）。在代謝指標中，甘油三酯水平與IRT δ厚度（24個月-12個月）呈負相關（r=-0.67，P<0.01）。
結論：在無血管視網膜病變和神經病變的T1DM兒童中，視網膜神經的早期形態學改變已經存在，支援RN發生在糖尿病早期的假設。GV似乎在T1DM兒童的神經感覺視網膜形態異常中發揮預測作用。將來需縱向評估以確定視網膜神經損傷是否可作為糖尿病神經病變的一種預測標誌物。
OP 06-36:羥苯磺酸鈣在亞臨床糖尿病黃斑水腫患者中的作用：CADODIAME研究
背景和目的：羥苯磺酸鈣（CaD）在多個國家被批准用於DR治療，多項隨機安慰劑對照臨床試驗證實了其對延緩早期DR進展的療效。然而，在CALDIRET研究中，CaD並未降低臨床顯著黃斑水腫（CSME）的發生風險。總的來說，這些研究資料表明，CaD用於早期DR有益，但還需更多臨床證據支援。視網膜厚度（RT）似乎是DME的一個良好預測指標，亞臨床DME患者是評估預防CSME治療策略的良好目標人群。在此基礎上，本研究旨在檢測CAD用於DR早期的作用，包括對亞臨床DME到CSME進展的影響。
材料和方法：在這項隨機、多中心、安慰劑對照、平行組研究中，60例符合條件伴亞臨床DME的2型糖尿病患者以1:1比例隨機接受CaD（1000 mg bid）或安慰劑治療，為期1年。主要終點是確定CaD能否預防RT增加。次要終點是評估CaD能否阻止：①亞臨床DME到CSME進展；②ETDRS進展（≥1步）；③神經退行性變進展；④視力下降；⑤中心凹無血管區（FAV）擴大。
結果：共有50例患者完成1年隨訪。CaD患者RT平均降低2.5 μm，而安慰劑組平均增加3.8 μm，但差異無統計學意義（P=0.26）。關於次要終點，唯一差異是CaD對ETDRS進展的影響：與安慰劑組的3例相比，CaD組的9例患者ETDRS有所改善（37.5% vs. 12%，P=0.05）。在校正年齡、高血壓和平均HbA1c（檢測4次）的logistic迴歸分析中，CaD治療與1年隨訪結束時ETDRS改善獨立相關（P=0.03）。安慰劑組和CaD組之間未發現任何不良反應差異。
結論：在本研究中至少1年隨訪後，CaD治療對RT進展無任何顯著影響。然而，ETDRS改善的結果表明，CaD是一種安全有效的治療DR早期微血管損傷的方法。未來有必要在更大規模患者中開展更長期隨訪的研究。
專家點評
匡洪宇 哈爾濱醫科大學附屬第一醫院
2021 EASD年會上關於DR的報道給我們帶來了新的資訊，從細胞、動物、人體研究等多維度探討了DR的發病機制、早期篩查及治療方法。①在細胞層面上，M. Aprile等人證實了MGO對人視網膜內皮細胞的轉錄和轉錄後影響，並構建了DR內皮損傷的mRNA-miRNA相互作用網路。②在動物層面上，H.R. Winter等人在生理性12h:12h光暗迴圈下分別飼養健康對照組和ins2kita/J糖尿病小鼠，發現視網膜轉錄組是有晝夜節律的，雖然12小時轉錄軸保留在糖尿病視網膜中，但其相位提前約1~3小時，這是首次對映糖尿病對視網膜節律性輸出影響的研究。③在一項隨機、多中心、平行、安慰劑對照研究中，證實CaD治療隨訪1年對RT進展沒有影響，但對早期微血管損傷有效。④ N. Vuori等利用全外顯子組和全基因組測序揭示了T1DM中SDR的新型罕見遺傳變異——UACA蛋白截短突變，此突變增加了T1DM患者的SDR風險。⑤ Menduni等人對25例接受CGM及皮下胰島素輸注治療的T1DM患兒（無任何併發症）連續隨訪2年，證實血糖控制情況和每日GV對T1DM兒童患者早期視網膜神經變性體徵的影響和預測作用。⑥ J. Mellor等人利用人工智慧技術，建立深度學習預測模型（RegNetY016）甄別黃斑病變患者的眼底影象，該模型AUROC值為0.85，明顯高於其他同類模型，有助於減少臨床醫生的工作量。
