影像學檢查和腫瘤活組織檢查是臨床上腫瘤診斷和監測的主要手段，這些檢查在治療前的確非常有效，但是頻繁和重複的影像學檢查及活檢用於術後監測是不切實際的。液體活檢（Liquid biopsy）技術是指透過採集和檢測人體體液樣本實現腫瘤監測的一種技術，雖然尿液、糞便、腦脊液、唾液、腹水等體液都是腫瘤源性物質的潛在來源，但血液仍然是主要的液體活檢樣本。
相比於傳統的腫瘤檢測方法，液體活檢技術具有取樣方式靈活、無創便捷、可以反覆多次取樣、依從性高等特點，因此可能在腫瘤篩查、療效檢測、用藥指導等方面發揮重要作用。
液體活檢與HPV病毒
液體活檢樣本中存在多種攜帶腫瘤相關資訊的物質，包括迴圈腫瘤細胞、迴圈腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和RNA、腫瘤細胞釋放的外泌體等等。其實正常人的血液中，也含有一些片段化的DNA，我們稱之為cfDNA，科學家認為這些cfDNA是透過細胞凋亡或者壞死釋放到血液中的，進入血液之後，cfDNA會被快速從血液中清除，半衰期不超過1小時，健康人血漿中的正常細胞的cfDNA含量是比較低的。
而ctDNA就是指從腫瘤細胞中釋放出來的DNA，與正常的cfDNA在序列特徵上有一些差別，因此，透過對血漿中ctDNA進行測序，就可以瞭解很多腫瘤的相關資訊，尤其是對於某些病毒感染引起的腫瘤，其cfDNA中往往含有很多病毒特異性的基因資訊。
人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種廣泛感染人類的病毒，大多數HPV的感染對人體無害，在兩年內可以被人體的免疫系統自行清除，但持續的高危型HPV感染可以導致多種癌症的發生，對全人類的健康造成嚴重威脅。
在美國，每年有1400萬人感染HPV病毒，大多數人一生中至少會感染1次HPV病毒，每年與HPV相關疾病（疣、癌前病變、癌）相關的總醫療費用高達80億美元。2009年，美國估計有34788例新發性與HPV相關癌症，包括宮頸癌、肛門癌、口咽癌和外陰癌等，其中最常見的口咽癌和宮頸癌，這些癌症中很大一部分由HPV16型和18型引起。
圖1 HPV 16型病毒粒子結構
在HPV病毒引起的腫瘤中，透過病毒基因組可以區分ctDNA和正常細胞來源的cfDNA，因此，可以對患者血漿中cfDNA進行檢測來了解患者的腫瘤負荷情況。
ctDNA可作為HPV引起腫瘤監測指標
一項研究探討了HPV相關的ctDNA作為口腔鱗癌復發的指標可行性。HPV引起的口腔鱗癌治療效果遠遠優於非HPV感染的口腔鱗癌，然而仍然有10%~25%的患者會在治療後出現疾病復發。CtDNA水平的動態變化與腫瘤的轉移或者患者的治療反應相關。
有研究納入了115例HPV相關的口腔鱗癌患者，所有患者均接受治療性放化療（CRT），患者接受3個月的治療性放化療後PET-CT，在之後的1~2年中，每2~4個月進行臨床評估，在3~5年期間每6個月進行一次評估。每6~9個月收集一次患者血液樣本，使用多重分析數字化PCR分析血漿中的HPV相關ctDNA，所有患者的中位隨訪時間為23個月。
圖2 DOI：10.1200/JCO.19.02444
其中，15名患者出現疾病復發，87例患者在治療後各個時間點均沒有檢測到HPV相關ctDNA陽性，這些患者也均未出現復發，28名患者在治療後監測中出現ctDNA陽性，其中15人復發，而16名患者連續2次血液檢測呈現陽性，復發的15名患者均在其中。HPV相關的ctDNA陽性與活檢證實復發之間的平均時間為3.9個月。
這項研究證實，基於HPV相關的ctDNA檢測用於HPV相關腫瘤復發的監測是可行的，其他一些類似的研究也驗證了這一結論。
然而，當下的ctDNA檢測多采用定量PCR（qPCR）和數字化PCR（dPCR），存在精度不夠的問題，當DNA的複製數小於1時，採用這些方法檢測會有一些困難，如何提高檢測的敏感性，是科學家一直關注的問題。
超高HPV ctDNA檢測助力腫瘤液體活檢
近日，來自加拿大多倫多的瑪嘉烈公主癌症中心的研究人員在Clinical Cancer Research上發表了一篇題為HPV sequencing facilitates ultrasensitive detection of HPV circulating tumor DNA的文章，這項研究提供了一種超敏感的HPV特異性ctDNA的檢測方法，HPV-seq大大提高了檢測的敏感性，能夠在dPCR陰性的治療後樣本中檢測到低至0.03 複製/ml的ctDNA。
圖3 DOI：10.1158/1078-0432.CCR-19-2384
圖4 HPV-seq和雙鏈雜交捕獲原理
HPV-seq採用了一種雙鏈雜交捕獲的方式從序列文庫中富集病毒DNA，能夠定性和定量地提供HPV相關腫瘤患者ctDNA的資訊，不僅具有超高的敏感性，而且能夠提供ctDNA的片段長度和HPV基因型資訊。每個全長的病毒基因組大約能夠產生50種不同的cfDNA片段。
結果顯示，HPV-seq 的結果和dPCR具有高度相關性，而且能夠檢測出dPCR不能檢測到的ctDNA，治療結束後檢測到HPV ctDNA與較差的無病生存期相關，其對疾病復發預測的敏感性為100%，特異性為67%。對HPV型別鑑定的準確率達到100%。HPV ctDNA片段的大小始終短於非癌症來源的cfDNA片段，並且在HPV基因組中觀察到固定的cfDNA片段組模式。
總之，本研究提出的HPV-seq確實是一種有效的ctDNA定量方法，優於傳統的dPCR。
透過這種超高敏感性的檢測方法，可以迅速發現患者是否有腫瘤復發的傾向，更早地採取行動，對於提高患者預後具有重要意義。同時，這項技術也可以用於其他由特定病原體引起的癌症的檢測和治療，造福更多腫瘤患者。
作者：殷其雷
來源：臨床前線
參考資料：
1、 Chera BS, Kumar S, Shen C, et al. Plasma Circulating Tumor HPV DNA for the Surveillance of Cancer Recurrence in HPV-Associated Oropharyngeal Cancer [published correction appears in J Clin Oncol. 2020 Oct 20;38(30):3579]. J Clin Oncol. 2020;38(10):1050-1058.
2、 Corcoran RB, Chabner BA. Application of Cell-free DNA Analysis to Cancer Treatment. N Engl J Med. 2018 Nov 1;379(18):1754-1765.
3、 王傳新.腫瘤液體活檢[J/OL].山東大學學報(醫學版):1-8[2021-09-30].
4、 Cheung TH, Yim SF, Yu MY, Worley MJ Jr, Fiascone SJ, Chiu RWK, Lo KWK, Siu NSS, Wong MCS, Yeung ACM, Wong RRY, Chen ZG, Elias KM, Chung TKH, Berkowitz RS, Wong YF, Chan PKS. Liquid biopsy of HPV DNA in cervical cancer. J Clin Virol. 2019 May;114:32-36.
5、 Eric Leung et al, HPV sequencing facilitates ultrasensitive detection of HPV circulating tumor DNA, Clinical Cancer Research (2021).
