數字 PCR (dPCR)可以提供比傳統qPCR更高的精準度和靈敏度，尤其是在腫瘤學應用中，dPCR能精準且可靠地檢測到較低濃度樣本中的稀有突變等。
目前，使用Drop-off方法可以同時檢測基因組內發生的多個序列插入、缺失或鹼基突變，最大限度地提高單個檢測中樣本的資料輸出，節省時間和檢測成本。本文以naica微滴晶片數字PCR平臺為基礎，對使用Drop-off方法檢測基因缺失進行闡述。
首先，為大家介紹一下Drop-off方法原理：
Drop-off是指利用探針在一個反應中檢測基因組序列的同源基因突變（包括核苷酸的缺失，插入和替換）。
Drop-off方法包括兩個TaqMan 探針：一個與野生型序列互補而與突變位點不發生互補的Drop-off探針和一個與突變型和野生型基因都互補的Reference探針（如下圖A）。
當野生型等位基因存在時，Drop-off探針和Reference探針都將與目標序列雜交，產生雙重陽性訊號（如下圖B，藍色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個核苷酸的突變也會阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針與目標基因結合，從而得到一個陽性訊號（如下圖B，綠色群）。
A.Drop-off和Reference探針及引物在目標基因上的示意圖（FP：上游引物，RP：下游引物）
B. Crystal Miner 2D圖中顯示來自雙陽性野生型等位基因的熒光簇（天藍色：藍色和綠色）和突變等位基因的熒光簇（綠色）及陰性微滴簇（黑色）。Drop-Off探針僅和野生型序列互補，而跳過突變序列（圖B，縱座標的藍色通道）；Reference探針與突變和野生型等位基因進行互補（圖B中橫座標的綠色通道）。
野生型濃度CWT可以直接從雙陽性微滴中PWT的比例得出。但是，Drop-off突變體濃度Cmut必須從確信包含突變等位基因的微滴比例Pmut中得出。
由於野生型和突變等位基因可能被分配到同一個微滴裡面，因此採用雙陽性微滴對突變體進行定量是不準確的，只能透過排除雙陽性微滴來確定Pmut（將突變陽性群體定義為對Reference探針呈陽性但對Drop-off探針呈陰性的微滴）。
上文已對檢測原理和檢測方法進行了闡述，那麼如何對Drop-off檢測結果進行分析呢？
1、使用高靈敏naica微滴晶片式數字PCR系統的藍色和綠色兩個通道對突變等位基因（MAF）進行絕對定量。
2、使用Crystal Miner分析軟體進行量化分析計算。
A 、透過自主圈群功能選中三種微滴群體並進行命名-突變型陽性（綠色），雙陰性（黑色），野生型雙陽性（天藍色：藍色和綠色）。
B、透過naica Crystal Miner軟體獲得Drop-off突變型的濃度Cmut（綠色），以及野生型濃度CWT（天藍色）。
C、計算MAF Drop-off突變，即MAF Drop-off=Cmut/（Cwt+Cmut）。（如想了解關於Cmut和Cwt詳細計算方法，可點選連結：
https://www.gene-pi.com/tutorial/drop-off-assay/）
小提示：
如果不排除雙陽性的微滴並將其歸為陰性微滴中， Drop-off突變體的MAF則會被低估，對於任何Cmut＜100cp/µL，這一系數幾乎是恆定的（例如在樣品中CWT為500 cp/µL時，低估了25%）。保留雙陽性微滴既不會降低測得的Drop-off突變體濃度的相對不確定性，也不會降低LOD。
應用亮點：
透過使用naica Crystal Miner圈群功能，可以對Drop-off突變進行精準定量。
排除模稜兩可的微滴，在不降低測量精度的前提下避免了低估Drop-off突變體的濃度。
本次檢測使用了naica微滴晶片數字PCR系統的藍綠兩個通道，第三個檢測通道還可以新增一個內部對照或同時量化一個MAF點突變。
naica微滴晶片數字PCR系統
法國Stilla Technologies公司的naica微滴晶片數字PCR系統在進行核酸檢測時具有獨特的優勢。該系統利用cutting-edge微流體創新型晶片—Sapphire晶片（或高通量Opal晶片）作為數字PCR過程的耗材。樣品透過毛細通道網格以30,000個微滴的形式進入2D晶片中。3色熒光檢測儀器，整個流程只需要2.5小時，並可進行資料的質控和結果追溯分析，獲得的資料真實可靠。
naica六通道微滴晶片數字PCR系統
法國Stilla Technologies公司naica六通道微滴晶片數字PCR系統，源於Crystal微滴晶片式數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智慧化識別微滴並進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對複製數濃度。
