野生二粒小麥抗白粉病基因MlIW172

野生二粒小麥品系IW172(原始編號G-797-M；圖1)是中國農業大學楊作民教授於1994年從以色列The Volcani Center, Agricultural Research Organization (ARO)的Gerechter-Amitai博士處引進的種質資源，高抗當時的小麥白粉病菌11號和15號生理小種，但很遺憾該份材料的種子未能儲存下來。2001年孫其信教授透過與以色列海法大學的Tzion Fahima和Eviatar Nevo博士合作，藉助中以農業研究基金專案重新引進了該資源，並安排博士研究生宋偉(2004.9-2007.6)對IW172的抗白粉病基因進行了遺傳和分子標記定位研究。該品系對目前我國的白粉病菌優勢菌系E09等許多菌系仍然保持良好的抗性(圖1)。

圖1 野生二粒小麥IW172和硬粒小麥Mo75的白粉病抗性反應(Wu et al. 2022)

透過抗性鑑定和遺傳分析，宋偉發現野生二粒小麥品系IW172對白粉病菌生理小種E09的抗性由顯性單基因控制，將其暫命名為MlIW172。透過BSA法和分子標記分析，找到與MlIW172連鎖的4個SSR標記、2個STS標記和1個EST標記(圖2)，構建了該抗病基因的分子標記連鎖圖譜，發現位於MlIW172兩側且距離該基因最近的兩個標記Xest92和Xmag2185與抗病基因之間的遺傳距離分別為2.2 cM和1.3 cM。SSR標記的中國春染色體缺失系物理定位結果表明，抗白粉病基因MlIW172位於小麥7A染色體長臂末端Bin7AL16-0.85-1.00(圖3)。

圖2 與MlIW172連鎖的SSR分子標記(宋偉 2007）

圖3 抗白粉病基因MlIW172遺傳連鎖圖譜(宋偉 2007）

與當時定位於該染色體區域的其它抗白粉病基因進行連鎖圖譜比較分析，結果表明MlIW172與Pm1、來源於烏拉爾圖小麥的PmU(Qiu et al. 2005)、來源於栽培一粒小麥的Mlm2033和Mlm80(Yao et al. 2007)均位於7AL染色體同一區域，推測它們可能是復等位基因，或者是7AL的該區域存在一個抗病基因簇(宋偉 2007)。

之後韓俊博士在攻讀博士學位期間(2006.9-2009.6)利用當時僅有的小麥EST序列和剛剛釋放的二穗短柄草基因組測序Scaffold序列以及水稻的基因組序列對MlIW172對應的基因組區段開展比較基因組學分析，利用短柄草的Scaffold序列和小麥的EST序列開發多型性分子標記，對MlIW172進行比較基因組學定位，將MlIW172定位於一個RGA基因簇中(圖4)。

圖4 MlIW172位點與短柄草和水稻的共線性區域比較圖譜(韓俊 2009)

歐陽姝虹在其博士學位論文中(2008.9-2014.6)對MlIW172進行了進一步的精細定位和物理圖譜構建。她利用IW172與高感白粉病硬粒小麥Mo75構建了含有4192個F2單株及其F2:3家系的精細定位作圖大群體。利用MlIW172基因組區域與短柄草1號染色體，水稻6號染色體和高粱10號染色體的共線性，透過比較基因組學分析，結合小麥的EST序列，開發出5個與MlIW172緊密連鎖的分子標記。透過篩選硬粒小麥Langdon的BAC文庫，對獲得的兩個陽性BAC克隆進行測序，開發出3個與MlIW72緊密連鎖的分子標記。利用MlIW172基因組區域短柄草共線性基因的CDS序列比對當時剛組裝出來的烏拉爾圖小麥Triticum urartu基因組scaffolds，找到scaffold25403 (333 kb)和scaffold96474 (61 kb)，並根據它們開發出5個與MlIW172緊密連鎖的分子標記。她還利用中國春7AL染色體測序組裝的BAC contig841序列開發了5個與MlIW172緊密連鎖的分子標記。將所有新開發的分子標記在精細定位大群體上進行檢測，構建了MlIW172高密度精細遺傳連鎖圖譜，將MlIW172界定到了遺傳距離為0.48 cM的遺傳區間(圖5)。

圖5 MlIW172物理圖譜(Ouyang et al. 2014)

近期，吳秋紅博士等繼續擴大Mo75 × IW172精細作圖群體，利用與抗白粉病基因Pm1a、Pm60、MlWE18和Mlm2033等緊密連鎖或共分離的分子標記構建了MlIW172的精細遺傳圖譜，將MlIW172定位於分子標記M405和WGGC4656之間0.048 cM的遺傳區間，對應普通小麥中國春7AL染色體233 kb物理區段，含有4個高可信基因(1個MFS、2個SPX和1個NLR)和3個低可信的NLR基因片段；對應野生二粒小麥Zavitan基因組7AL約1 Mb物理區段，含有14個預測的基因；對應烏拉爾圖小麥G1812基因組7AL約800 kb，含有18個預測的基因(圖6)。有4個利用BSA+CGT-Seq開發的NB-ARC序列分子標記CGT1、CGT2、CGT3和CGT4(Wu et al. 2021)與MlIW172共分離，但這些標記序列在感病親本Mo75中均缺失，表明MlIW172基因位於一個NLR基因族中，該區段在IW172、Mo75、中國春、Zavitan和G1812間存在NLR基因序列有無變異(Presence and absence variation, PAV；圖6B)。

圖6 野生二粒小麥抗白粉病基因MlIW172的圖位克隆(Wu et al. 2022)

RT-PCR結果表明這些NLR序列中只有CGT3相關的NLR基因在白粉病菌接種前後均表達(圖6C)，且該基因在接種E09後8小時有顯著的表達上調(圖6D)。該基因編碼一個典型的CC-NBS-LRR蛋白，含有1454個氨基酸，與已克隆的來源於野生二粒小麥抗白粉病基因MlWE18間存在4個SNP，其中2個導致氨基酸序列變異(圖6E)；與烏拉爾圖小麥中的Pm60基因相比存在9個SNP，其中3個為非同義氨基酸變異。據此推測，IW172中的這個NLR可能是Pm60和MlWE18的功能等位基因，因此進行了後續的功能驗證。

首先利用EMS誘變野生二粒小麥IW172，利用白粉病菌E09菌系接種鑑定了2830個M2家系，篩選到9個存在抗、感分離的家系。對這9個純合感病突變體及其抗病姊妹系和野生型中的NLR基因進行序列比較，發現其中的2個突變體由於點突變產生了提前終止，另外7個突變體產生了氨基酸序列變異(圖7)，表明該NLR決定IW172的白粉病抗性。

圖7 野生二粒小麥抗白粉病基因MlIW172的突變體功能驗證(Wu et al. 2022)

為進一步驗證該NLR的抗白粉病功能，構建了該NLR自身啟動子驅動的NLR基因組序列轉基因載體，透過農桿菌介導的方法遺傳轉化高感白粉病小麥品種Fielder，獲得4個含有目的基因的轉基因T1代家系，其中的轉基因陽性苗表現高抗白粉病(圖8)，證實了該NLR為MlIW172的功能基因，是Pm60基因在野生二粒小麥中的一個新等位基因。

圖8 野生二粒小麥抗白粉病基因MlIW172的轉基因功能驗證(Wu et al. 2022)

接下來進一步研究了Pm60基因在野生二粒小麥自然群體中的等位變異。透過NLR特異序列擴增和序列比較，在217份野生二粒小麥自然群體中檢測到70份含有Pm60的等位基因序列，其中56份來自於以色列，5份來自於敘利亞，9份來自於巴勒斯坦，而且這70份野生二粒小麥均抗白粉病菌E09菌系；23份來源於土耳其的野生二粒小麥全部高感白粉病，其中均未檢測到Pm60的等位基因序列。從這70份野生二粒小麥中擴增出的Pm60等位基因DNA序列可分為8種單倍型(Hap 1 - Hap 8，圖9)，但由於部分序列變異為同義突變，在蛋白質水平上可劃分為4種新的單倍型(圖10)。另外，來源於野生二粒小麥品系G16中的抗白粉病基因PmG16(Ben-David et al. 2010；Li et al. 2021)屬於Hap 1，來源於野生二粒小麥品系IW72中的抗白粉病基因MlIW72(Ji et al. 2008)屬於Hap 2。非常有意思的是，從野生二粒小麥中發掘出的Pm60等位基因(包括MlWE18、MlIW172和Hap 1 - Hap 8)與從烏拉爾圖小麥中發掘出的Pm60等位基因(Pm60、Pm60a和Pm60b)間具有共同的4個單核苷酸序列變異(Single Nucleotide Variation，SNV；圖9)，分別位於NLR蛋白的近CC結構域、NB-ARC結構域和LRR結構域。這可能反映了該基因在這兩個物種間的序列分化，擬或者是等位基因間的抗譜分化。在序列進化樹上，PM60及其等位基因位於一個分支，與其序列相似性最高的是抗葉鏽病蛋白LR1，氨基酸序列的一致性僅為49%(圖10)。

圖9 Pm60基因在烏拉爾圖和野生二粒小麥中的單倍型變異(Wu et al. 2022)

圖10 PM60抗病蛋白與部分已知抗病蛋白的聚類分析(Wu et al. 2022)

Pm60、Pm60a、Pm60b、MlWE18和MlIW172對20個小麥白粉病菌系的抗譜存在一定差異，結合編碼NLR蛋白的序列變異，表明它們是具有抗白粉病功能的不同等位基因。在7AL染色體上還存在多個已經鑑定到的抗白粉病基因/等位基因，如Pm1a、Pm1c、Pm1e、NCA4、NCA6、NCAG11 (Pm37)、Mlm2033、Mlm80、PmTb7A.1、PmTb7A.2、Pm60、PmU、MlAG12、HSM1、Pm9、mlRD30和PmG16。我們對其中部分種質材料中的Pm1a和Pm60等位基因進行了檢測，結果發現攜帶Pm1c、Pm1e、NCA4、NCA6和NCAG11 (Pm37)基因的抗白粉病種質(圖11)中均未檢測到Pm1a和Pm60等位基因序列，表明這些基因資源7AL染色體上含有其他不同於Pm1a和Pm60的抗白粉病基因，值得進一步研究和加快育種利用。

圖11 部分7AL染色體上攜帶抗白粉病基因種質的白粉病抗性(Wu et al. 2022)

2022年2月12日，上述研究結果以“Functional characterization of powdery mildew resistance gene MlIW172, a newPm60allele and its allelic variation in wild emmer wheat”為題線上發表於Journal of Genetics and Genomics雜誌。

參考文獻

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