人類大腦的神經迴路是一個極其複雜而巨大的網路，包含數百億個神經細胞，這些細胞又透過數十萬億計的連線點（神經突觸）交織在一起，構成了我們思維、記憶和感情的基礎。如果只瞭解神經迴路中單個分子或單個神經細胞的工作機理，而不瞭解多個神經細胞連線起來形成的整體網路結構和集體行為方式，是無法理解大腦複雜且高等的功能與活動的，也無法解釋很多腦部疾病的致病機理和發展過程。
圖1 大腦依賴複雜的神經迴路行使功能（圖片來自網路）
隨著科技的發展，腦神經網路結構的神秘面紗正逐漸被揭開。在這個過程中，各類成像方法是必不可少的手段。利用磁共振成像（MRI）、正電子發射斷層掃描（PET）等技術，可以在宏觀解析度（亞毫米）下看到大腦內部各個腦區間的連通特徵。層出不窮的各種以熒光成像為主要手段的光學顯微技術，讓科學家們能夠觀察到介觀解析度（亞微米）下單個神經細胞的投射模式與神經活動。而最近十年間發展起來的連續斷層掃描電子顯微鏡（sSEM），使得在微觀解析度（奈米級）下獲取包含著神經突觸連線細節的三維神經聯接圖譜成為可能。
然而，如果把一個動物的大腦比喻作一片廣闊森林的話，目前還沒有一項技術能夠同時看到整片森林中的每一棵樹（神經細胞），並分辨清楚樹上面的每一片樹葉（神經突觸）。
MRI、PET的解析度太低，只能看到樹木的群落，識別不出單獨的樹木。而諸多熒光顯微成像技術雖然能夠分辨出單獨樹木，但需要對森林進行稀疏的熒游標記，讓其中極少比例的樹能夠發光，才能觀察到這些被“點亮”了的樹，而其餘未點亮的樹木就只能是一片片觀察不到的“黑暗森林”。而且，受限於解析度，熒光顯微成像也不能分辨出樹葉的形狀、數量和分佈。連續斷層電子顯微鏡雖然能夠看清極小範圍內的所有樹木和所有樹葉，但受限於成像速度和難以想象的龐大資料量，卻很難擴充套件到觀察整片森林的規模。
圖2 熒光顯微技術所展示的腦中單個神經細胞影象（上）；只“點亮”少數樹木，無法揭示整片森林的全貌（下）（圖片均來自網路）
為了解決這個極具挑戰性的問題，中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所張若冰課題組提出一種創新性的光學成像方法，光學多層干涉斷層成像（Optical Multilayer Interference Tomography, OMLIT），能夠在介觀解析度下獲取腦組織中所有細胞的光學影象，同時能與連續斷層掃描電鏡（sSEM）無縫銜接，進一步對樣本區域性區域進行更精細的微觀解析度成像，從而融合光、電顯微成像技術的優勢，做到“既見森林，也見樹木，可見樹葉”。
圖3 兩個對比度相反的系列的OMLIT影象
研究團隊設計、構造、並仔細測試了一系列多薄層結構，包括不同基底材料、鍍層材料、鍍層厚度、超薄腦組織樣品厚度等條件，尋找到了使成像結果最為最佳化的幾種多薄層結構模式。在這些條件下，均能夠清晰地拍攝出小鼠大腦皮層組織樣品中的所有細胞，識別出神經細胞和膠質細胞的形態以及空間分佈，並重建出軸突、樹突、毛細血管等形成的複雜交織網路結構。令人驚訝的是，不同的多薄層條件可以使神經組織顯示出對比度完全相反的影象（圖4），說明它們並非是由於簡單的吸收或散射形成的。
圖4 OMLIT多層反射與干涉模型和腦組織樣本神經細胞結構示意圖
研究人員建立了一個光波在不同薄層介質間多次反射和干涉，形成超薄切片樣品中所有細胞高對比度影象的理論模型（圖4），很好地解釋並模擬了這一成像現象。樣品層內神經細胞結構和包埋樹脂之間光學性質具有差異，光波經過多層薄膜的反射之後，各層反射光相疊加發生干涉，提高了生物組織與樹脂之間的明暗差異（圖5），巧妙地達到了增加對比度的效果。
圖5 增反的干涉波形。反射光強度變大，更亮。（左）
增透的干涉波形。反射光強度變小，更暗。（右）
OMLIT使快速重建介觀解析度下所有神經細胞的形態、分佈和投射圖譜成為可能，並且可以無縫銜接連續斷層掃描電子顯微成像（sSEM），實現在同一動物腦組織樣本上進行全細胞光學成像和電鏡成像。透過對OMLIT影象中區域性區域的樣品進行奈米級解析度sSEM成像，研究人員驗證了兩種不同模態成像技術之間的相容性，以及所重建的三維結構之間的可融合與互補性（圖6）。同時，OMLIT也為sSEM提供精確的成像區域（ROI）畫界與導航。
圖6 使用 OMLIT 和 sSEM 對小鼠大腦皮層組織同一區域三維重構的結果
該研究首次在同一個腦組織樣本中，實現所有細胞的介觀解析度光學成像與微觀解析度電鏡成像。進一步發展並應用OMLIT方法，我們將能夠在同一動物大腦中解析出包含所有細胞的完整神經網路的介觀長程投射組圖譜（Projectome），並且在選定的重點區域，透過銜接sSEM，繪製出完整的微觀本地聯接組圖譜（Connectome），鑲嵌入介觀長程投射譜的背景中。並且，OMLIT的腦樣品庫可以很方便地長期儲存，能夠隨時選擇繪製其他區域的微觀神經聯接組圖譜。
在當前成像技術和影象處理能力的制約下，由於過於巨大的時間消耗和資料量，單純使用sSEM繪製全域的微觀解析度神經聯接組圖譜是不現實的。而利用OMLIT銜接sSEM繪製同一動物的全域介觀＋局域微觀融合腦圖譜是一條非常可行的路線。全細胞介-微觀融合腦圖譜將能夠提供腦神經迴路在不同尺度下的空間與結構特徵，幫助解析神經網路不同層級的結構基元和交聯規律，預期將推動基於自然智慧構造新一代人工智慧的進步。
相關成果已經以 Optical Multilayer Interference Tomography Compatible with Tape-Based Serial SEM for Mesoscale Neuroanatomy 為題線上發表在ACS Photonics上，並選為補充期刊封面。
論文連結：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsphotonics.1c00892
來源：中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
