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Piezo的結構解析之路
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編者按：2021年獲諾貝爾生理或醫學獎的piezo蛋白，曾由清華大學楊茂君教授及其課題組率先培養、解析。他們的這一探索性研究在相當程度上促進了piezo蛋白領域的其他研究，為幫助讀者瞭解這項研究的難度和價值，本期我們邀請到清華大學生命科學學院的楊茂君教授介紹piezo蛋白結構解析的重要科研成果和創新突破。
2021年諾貝爾生理或醫學獎由加州大學舊金山分校的David Julius，和Scripps研究所的Ardem Patapoutian兩位學者共同獲得，其主要獲獎工作分別是發現了溫度和觸覺受體，相對應的蛋白家族分別為瞬時感應受體家族（Transient Receptor Potential，TRP）和機械敏感通道Piezo家族。
作為一名結構生物學家，我和我的課題組長期開展機械敏感通道相關研究，並解析了首個Piezo蛋白的三維結構。有幸收到“清華思客”的邀請，我向廣大讀者介紹Piezo結構解析的故事。
2021年兩位科學家因為分別是發現了溫度和觸覺受體而獲得諾貝爾生理或醫學獎
1 Piezo課題前的技術積累
自2008年加入清華大學以來，我和我的團隊一直以結構生物學為主要研究手段，結合生物化學和細胞與分子生物學，從事細胞感應外界訊號以及細胞能量代謝相關蛋白質的結構與功能研究。在理論研究之外，團隊還以這些生物大分子的高分辨結構為基礎，開展藥物設計及臨床應用研究，取得了一系列重要研究成果。課題組在世界頂級期刊Nature、Science、Cell等雜誌陸續發表多篇論文，同時獲得了兩項藥物開發專利。
人類如何感知外界訊號刺激是我們的重點研究方向之一，具體包括人類如何感受溫度、痛覺和機械力刺激等等。我們的一項代表性工作是在騰衝嗜熱菌中鑑定了一種陰離子選擇性的機械敏感通道TtMscS，並且解析了其三維晶體結構，透過結構與電生理研究解釋了其陰離子選擇性的分子機理1。
經過幾年的技術積累和學生培養，我們開始對探究真核生物的機械敏感通道發起挑戰。當時，一些離子通道，例如TRP通道，鉀離子通道和DEG/ENaC也被認為具有機械敏感性，然而這些通道的機械敏感性更像是他們的“附加屬性” （在受到其它物理化學刺激啟用的同時也具備一定的機械敏感性），並不能解釋哺乳動物的很多機械敏感相關生理過程。
直到2010年Piezo蛋白功能的發現，以及2012年Piezo作為離子通道的鑑定，一類全新的哺乳動物機械敏感離子通道蛋白家族出現在大家的眼前——於是，攻克Piezo蛋白的結構就成為了那一時期我所在實驗室的工作重點。
2 Piezo 蛋白前期的蛋白質晶體學嘗試
在當時的條件下，真核生物膜蛋白的結構具有極高的研究難度。我們開始做Piezo課題的時候，蛋白質晶體學仍然是結構解析的最主要手段，並且世界上只有少數的幾個課題組解析過真核膜蛋白的結構。該方向的主要難點在於高質量樣品的表達純化以及結晶過程。而Piezo的分子量特別大（單體含有超過2500個氨基酸），具有已知離子通道中最多的跨膜螺旋數量，同時由於其機械敏感特性，過量表達往往會對細胞產生毒性。這些特點對Piezo的表達量和晶體生長造成了很大的負面影響。
結構生物學研究同時需要巨大的腦力和體力付出。當時課題組的三年級博士生蓋景鵬同學（現為上海科技大學常任教授，國家蛋白質科學研究上海設施雙聘研究員）帶領著我實驗室的博士生李若翀同學，和剛剛入職清華大學藥學院的肖百龍研究員課題組成員趙前程同學（現為耶魯大學博士後），為這個課題的成功完成付出了巨大的努力。
蓋景鵬博士帶領兩位新同學首先重點優化了Piezo蛋白在哺乳動物貼壁細胞中的表達與純化條件的研究，修正了Ardem Patapoutian研究組得出的這個蛋白是一個四聚體的錯誤結論。為了拿到足夠的piezo蛋白，他們需要每週培養數百盤細胞，全年節假日無休。更值得一提的是，蓋景鵬博士當時自己開發了一套高通量的去汙劑（影響膜蛋白性質的最重要因素之一）篩選方法，從200多種去汙劑中找到了最適合穩定Piezo蛋白的三種，最終確定了該蛋白的表達、純化條件。
培養表達Piezo蛋白用到的平板
經過複雜漫長的培養篩選過程，團隊終於拿到了高質量的、可以滿足晶體生長要求的蛋白，並且採取多種結晶手段獲得了蛋白質晶體。儘管這些晶體並沒有很好的衍射來進行結構解析，但是這些前期研究結果為我們後期使用單顆粒冷凍電鏡技術來解析這一重要蛋白的結構，奠定了堅實的基礎。
培養表達Piezo蛋白
3 Piezo的冷凍電鏡結構研究
冷凍電鏡技術經過數十年的發展，在硬體和軟體上都取得了巨大的進步， 2013年底，美國加州大學舊金山分校的程亦凡和David Julius合作利用最新研發出來的直接電子計數照相機（K2相機）收集資料，並解析了首個TRPV1蛋白的高解析度冷凍電鏡結構。這一硬體技術的發展直接為冷凍電鏡領域打入一劑強心針，並且引導了世界上諸多結構生物學研究組開始把冷凍電鏡技術作為結構解析的重要手段。
在看到這一成果後，我們果斷轉身，充分學習並將冷凍電鏡技術作為Piezo結構解析的研究手段。儘管當時我們只能獲得很有限的冷凍電鏡機，但透過與高寧課題組李婉秋博士（現為南方科技大學醫學院助理教授、副研究員）合作，也得益於前期打下的良好生物樣品基礎，我們率先獲得了Piezo蛋白中高解析度的冷凍電鏡三維結構，揭開了這一重要蛋白的神秘面紗2，讓人們第一次在分子水平上看到了Piezo蛋白的樣子。
Piezo蛋白中等解析度結構
4 Piezo蛋白首個結構的重要意義
科學研究重要性的一個評判標準在於該研究對相關領域的促進性以及不可替代性，因此第一個發現往往具有最重要的推動作用。例如， David Julius 和Ardem Patapoutian的研究分別開啟了各自的領域，不僅他們各自的課題組在後續研究工作中做出了出色的研究成果，同時也引起了全世界很多課題組的共同興趣。相關領域內所有研究人員的共同努力使我們今天對感受溫度的TRP家族和感受壓力的Piezo家族蛋白從功能到結構上都有了較為深刻的認識，這些研究結果又促使他們獲得了2021年的諾貝爾生理或醫學獎。
我們團隊對Piezo結構的首次解析，不僅在分子水平上揭示了Piezo蛋白獨有的結構特點，為Piezo的功能研究提供了堅實的分子基礎，也為之後的結構生物學領域在研究方法上指明瞭道路。
在我們2015年報道Piezo首個結構的三年後，肖百龍課題組、Ardem Papaoutian 課題組以及Roderick Mackinnon（2003年諾貝爾化學獎）課題組又分別報道了Piezo1蛋白更高解析度的結構。其中，前兩者使用了與我們完全相同的質粒和純化方法，後者使用了我們篩選確定的去汙劑。我們很高興看到團隊前期探索性的研究成果可以對其他研究起到促進作用，並且推動整個領域的前進。
5 Piezo課題培養的科研人員
透過對Piezo結構這一世界性難題的攻克，我們課題組培養了多位出色的科研人才。
其中，文章的第一作者蓋景鵬同學於2015年博士畢業後加入美國Vollum研究所Eric Gouaux課題組繼續進行機械力相關的課題研究，首次報道了聽覺機械轉導訊號複合物組分PCDHL15-LHFPL5複合物的結構3，這也是目前為止已知的唯一的聽覺訊號轉導複合物結構。此外，該課題組還首次報道了聽覺訊號放大過程起關鍵作用的電動蛋白Prestin的結構與工作機理4。蓋景鵬博士於2021年11月加入上海科技大學生命科學與技術學院任常任教授，繼續從事對感覺神經系統分子機理的深入研究。
文章的另一位共同第一作者李婉秋博士，於2017年博士畢業後加入南方科技大學Dinshaw J. Patel課題組從事表觀遺傳調控分子機制相關研究。該團隊首次報道了組蛋白甲基轉移酶NSD2、NSD3分別與核小體的複合物的高解析度冷凍電鏡結構，揭示了NSD家族蛋白特異性識別和甲基化組蛋白H3K36的分子機制，以及致癌突變蛋白增強NSD蛋白催化活性的分子機理，為針對NSD家族蛋白過量表達和突變等引起的多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞白血病的靶向治療研究奠定了分子基礎。李婉秋博士在2020年加入南方科技大學醫學院並建立自己獨立的實驗室。
參考文獻：
1. Zhang, X. et al. Structure and molecular mechanism of an anion-selective mechanosensitive channel of small conductance. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 18180-18185, doi:10.1073/pnas.1207977109 (2012).
2. Ge, J. et al. Architecture of the mammalian mechanosensitive Piezo1 channel. Nature 527, 64-69, doi:10.1038/nature15247 (2015).
3. Ge, J. et al. Structure of mouse protocadherin 15 of the stereocilia tip link in complex with LHFPL5. Elife 7, doi:10.7554/eLife.38770 (2018).
4. Ge, J. et al. Molecular mechanism of prestin electromotive signal amplification. Cell 184, 4669-4679 e4613, doi:10.1016/j.cell.2021.07.034 (2021).
作者簡介
楊茂君
楊茂君，清華大學長聘教授，2008年加入清華大學生命科學學院。先後獲得長江學者特聘教授，國家傑出青年基金，霍英東基礎研究獎，樹蘭醫學獎青年獎，北京市戰略科技人才，談家楨生命科學創新獎，茅以升北京青年科技獎，藥明康德生命化學研究獎，萬人計劃科技創新領軍人才，北京市科技獎基礎類二等獎，吳階平-保羅·楊森醫學藥學獎，國家中青年科技創新領軍人才，國家重點研發計劃首席科學家，教育部新世紀優秀人才支援計劃，2016年度中國生命科學領域十大進展，《細胞》出版社2016中國年度論文獎等獎勵和支援。
研究方向：主要以結構生物學結合細胞與分子生物學和生物化學為研究手段，從事細胞感應外界訊號以及細胞能量代謝相關蛋白質的結構與功能研究，並以這些生物大分子的高分辨結構為基礎開展藥物設計及臨床應用研究。
學術成就：先後發表SCI論文80餘篇。自2008年加入清華大學以來，先後在《Nature》（2012；2015；2016）、《Cell》（2016；2017）和《Science》(2019) 等雜誌發表通訊作者SCI論文50餘篇。已獲授權專利兩項。首次報道了二型線粒體呼吸鏈複合物I的晶體結構，並對其功能、工作機制及藥物研發進行了詳細的研究；首次發現哺乳動物及人源線粒體呼吸鏈電子傳遞鏈超超級複合物和ATP合酶超超級複合物，並報道了它們的冷凍電鏡高解析度三維結構，為相關藥物開發奠定了良好的基礎。
供稿 | 楊茂君
約稿 | 張榕瑤
編輯 | 張榕瑤
排版 | 惠 珺
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