點選上面“藍字”關注我們！
今天推送的文章是山東大學微生物技術研究所的王祿山教授團隊於2020年5月份在Frontiers in Microbiology期刊上發表的Insights Into the Role of Exposed Surface Charged Residues in the Alkali-Tolerance of GH11 Xylanase。
耐熱和耐鹼或耐酸的木聚糖酶在農業和工業領域更具優勢。本研究基於耐熱GH11木聚糖酶TlXynA進行合理設計，以提高pH耐受性。透過定點突變替換表面電荷殘基構建了四種突變酶（P1、P2、P3和P4）和五種變體（N1、N2、N3、N4和N5）。與野生酶相比，突變體P1和P2表現出更高的耐酸性。此外，四個突變體N1、N2、N3和N4對鹼性環境（pH 7.0-9.0）的耐受性高於野生酶。
為了研究與GH11木聚糖酶離子抗性相關的決定因素，對其系統發育樹和氨基酸組成進行了分析。圖1顯示，根據蛋白質序列的相似性，GH11木聚糖酶分為兩個組：細菌和真核生物。其中，選擇了三種木聚糖酶進行進一步研究（表1）。XynJ（PDB ID:2DCJ）其最適pH為9。在pH值為5-9.5時，活性為最佳活性的60%。XynC（PDB ID:1BK1）是一種耐鹽酸性木聚糖酶，最適pH值為2.0。TlXynA（PDB ID:1YNA）是一種最適pH為6的耐熱酶，並且與AkXynC的進化關係比與BsXynJ的進化關係更為密切（圖1）。
進行序列比對以分析三種酶（圖2A）。TlXynA和BsXynJ序列相似性為44.44%，TlXynA和AkXynC的序列相似性為75%。圖2B顯示，耐酸耐鹽木聚糖酶AkXynC含有極少數帶正電的氨基酸（2.73%），TlXynA含7.75%的帶正電的氨基酸，BsXynJ為16%。鹼性木聚糖酶BsXynJ的帶負電荷殘基（Asp和Glu）百分比（8.16%）低於TlXynA和AkXynC。接下來，以TlXynA為模板構建GH11家族酶表面極性殘基的序列圖譜。圖2C顯示了9個帶正電的氨基酸和17個帶負電的氨基酸。選擇Arg116、Lys119、Arg161和Arg187四個帶正電荷的表面殘基進行突變。根據AkXynC的序列，它們分別突變為非極性殘基谷氨醯胺、蘇氨酸、谷氨醯胺和絲氨酸（圖2C）。此外，六個非保守帶負電荷的表面殘基Glu31、Glu36、Glu63、Glu109、Asp143和Asp157被突變為不帶電荷的氨基酸（天冬醯胺或絲氨酸），以降低帶負電荷殘基的比率（圖2C）。
WT和突變酶的二級結構沒有改變（圖3），3D結構也沒有太大變化。透過DSC測定純化蛋白的熱穩定性。如圖3A所示，除P3和P4外，這些酶的熱穩定性沒有受到顯著影響。與野生型酶相比，突變體P3和P4的Tm值降低了∼10℃，這些突變可能破壞了表面相互作用網路。圖3B顯示P1和P2突變體的活性分別增加了16%和30%，然而P3和P4突變體的活性略有下降。在pH 3-8測定這些酶的催化活性（圖3C）。結果表明，WT和突變酶最適pH值均為6.0，除P4突變體外，其他突變體的活性與WT的結果不一致（圖3C）。pH值為3時，P1和P2分別表現出50%和40%的最大活性，而WT和其他兩種突變酶幾乎完全失活。這些結果表明，P1和P2突變體對酸性環境更具抗性。圖3D顯示，當向反應系統中新增NaCl時，所有四種突變體的相對酶活性均高於WT。這些結果表明，這四個突變體對高濃度鹽離子的耐受性增強。
此外還突變了一系列帶負電的氨基酸，透過DSC測定純化蛋白質的熱穩定性（表4）。與WT相比，N1、N2和N3的熱穩定性幾乎沒有變化，而N4和N5的熱穩定性略有下降。圖4A顯示N2和N3突變體的酶活性分別增加了13%和16%，而N5突變體的酶活性最低（圖4A）。酶活性增加的主要原因是這兩個突變體的週轉率（kcat）高於WT。在pH 3-9測定這些酶的催化活性。圖4B顯示，這些突變體的最佳pH值與WT相同。除N5突變體外，隨著pH值的增加，其他突變體的活性曲線下降速度比WT慢。此外，在pH值為9時N1、N2、N3和N4分別表現出86、78、77和66%的最大活性，而WT和N5保留了最大活性∼60%的酶活性（圖4B）。綜上所述，除了N5突變體外，這些突變體對鹼性環境的耐受性更強。
在自然界中，中性環境是大多數酶最常見的催化條件，這些條件包括中等溫度、pH值和鹽度範圍。苛刻的條件通常會導致酶分子迅速變性。目前，蛋白質工程方法的利用賦予了更好的酶學性質，以適應廣泛的應用。此外，在蛋白質表面電荷工程方面也取得了重大進展，修飾表面電荷已越來越多地用於增強酶的性質。在本研究中，比較和分析了天然存在的酸穩定酶、鹼穩定酶和中性酶的帶電錶面殘基，並鑑定和突變了可能影響pH耐受性的氨基酸殘基。
雖然很難知道每種氨基酸在酶的整體性質中的作用，但同源蛋白質的比較可能證實氨基酸頻率的一些重要趨勢，這些趨勢可能與蛋白質在極端環境中的適應性有關。酸性和嗜鹽酶含有最少帶正電的氨基酸，鹼性酶含有較少帶負電的氨基酸。三種適應不同環境的木聚糖酶的表面也發生了變化（圖5）。極端嗜酸的木聚糖酶的表面上發現了更多帶負電荷的殘基。鹼穩定性木聚糖酶BsXynJ表面上含有大量的帶正電殘基（圖5）。這些結果表明，蛋白質表面帶負電和帶正電殘基比率的變化有助於GH11木聚糖酶適應極端pH環境。
本文采用的合理設計策略對酶的pH耐受性設計是有效的。首先，根據蛋白質的效能選擇相應的結構域，然後透過自然進化分析確定突變位點和突變方向，最後進行實驗驗證。結果表明，表面殘基Arg187和Glu36可能會影響酶的熱穩定性，氨基酸質子化狀態的變化通常會改變蛋白質結構中的靜電相互作用和空間排列。
整理:閆亞茹
文章資訊:
PMID: 32457729
DOI: 10.3389/fmicb.2020.00872
文章連結: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32457729/
