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精準治療，檢測先行！一文教你讀懂基因檢查報告中的MET 14號外顯子跳躍突變。
MET TKI在國內外相繼獲批治療MET 14外顯子跳躍突變的晚期NSCLC，MET 14號外顯子跳躍突變進入精準治療時代。但是報告怎麼看，卻讓人很頭大！醫生們臨床上看到的檢測報告可能是這樣的：
圖1 基因檢測報告展示
到底以上哪個報告是MET 14號外顯子跳躍突變呢？本文教你一文讀懂MET檢測報告！
別急，看檢測報告前，先了解下面資訊做足準備。
報告的突變型怎理解？
開頭提到的MET變異型別，如c. 3028+3 A>T, p.S531C，醫生們經常會有疑問，這些要怎麼理解。其實，上面的這些變異都是根據HGVS（human genome variation society，人類基因組變異協會）標準命名規則表示的。一般包括參考資訊來源[如“c.”代表編碼DNA參考序列，“p.”代表蛋白（氨基酸）參考序列]，位置編號（一般根據參考序列資訊，如c. 3028就是編碼序列的第3028個核苷酸）以及具體發生的改變（DNA 層面就是核苷酸的變化，包括>點突變、ins插入、del刪失等；蛋白層面的改變，氨基酸的變化）。
一般DNA變異命名參考都是編碼DNA序列，但是一些變異可會發生在非編碼區，如本文介紹的MET 14號外顯子跳躍突變。對於這些變異位點，沒有對應的位置編號，需要用附近編碼區的位置編號作為定位參考，上游使用“-”，下游使用“+”來進行表示。
現在再看看開始提到的幾個變異型。
c. 3028+3 A>T，在第3028號編碼核苷酸下游第三個非編碼的核苷酸發生了點突變，從A變成T。p.S531C，蛋白第531號氨基酸從S（絲氨酸）變成了C（半胱氨酸）。
注：突變會因生信分析時參考轉錄本不同而比對出不同的結果，會導致位置編號不同。如參考MET基因NM_000245.3轉錄本，突變為c. 3028+3 A>T；但如果參考MET NM_001127500.3轉錄本，同一突變則表示為c. 3082+3 A>T。下列介紹均基於NM_000245.3轉錄本資訊。
什麼是MET 14號外顯子跳躍突變？
MET 14號外顯子跳躍突變是指MET mRNA中14號外顯子丟失的現象，通常由RNA剪接異常造成。那什麼又是RNA剪接？
DNA是由非編碼的內含子區域和編碼的外顯子區域交錯組成。在由DNA轉錄到mRNA再翻譯為蛋白的過程中，需要將內含子剪下除去，並將外顯子有序連結形成一個連續的RNA（mRNA）分子。這就是RNA剪接過程（如圖）。
圖2 RNA剪接過程
RNA剪接過程需要識別內含子上的多個區域。這些區域如果遭受到破壞或受影響，都可能導致RNA剪下異常。MET 14號外顯子周圍內含子的剪下相關區域發生突變時，導致外顯子14被錯誤剪下而丟失，即所謂“MET 14號外顯子跳躍突變”。
圖3 MET 14外顯子跳躍
MET 14號外顯子跳躍突變會導致其編碼的蛋白近膜結構域（JM）缺失。該結構中的Y1003殘基是E3泛素連線酶CBL的結合位點，CBL結合Y1003殘基將介導MET泛素化，導致MET蛋白降解，是MET蛋白主要的負調控機制。當該區域缺失時，會導致MET受體泛素化降低，MET蛋白降解降低，最終導致下游訊號通路的持續啟用，從而導致腫瘤發生（如圖）。
圖4 MET ex14 RNA正常剪接的生物學結果（左）和異常剪下的生物學結果（右）[1]
導致MET 外顯子跳躍的突變區域有哪些？
上文提到發生在內含子區域的突變可能會導致外顯子跳躍，那MET 14號外顯子跳躍突變的區域有哪些？下圖詳細介紹了MET 14號外顯子跳躍突變的區域，主要包括14號內含子的5'端剪接供體位點（splice donor, SD site）和13號內含子3'剪接受體位點（splice acceptor, SA site）、分支位點（Branch site, BS）和多嘧啶位點（Poly-pyrimidine tract，PPT）等。
圖5 發生MET 14號外顯子跳躍突變的位置[2]
據累及的功能位點的差異可以分為兩大類：
一類是基因變異累及邊緣經典剪接區，即位於內含子邊緣SA和SD區域，如圖5A所示。經典剪接區上發生的點突變或插入缺失（indel）可導致剪下子無法識別剪接受體或供體位點，從而導致MET外顯子14的異常剪下。
SA site
邊緣1-2bp位置發生的點突變有c.2888-1，c.2888-2可直接判定為MET 14號外顯子跳躍突變，例如c.2888-1G>A等。除點突變外，累及該區域的插入/缺失也可導致MET 14號外顯子跳躍突變，例如c.2888-7_c.2920del。發生在該區域的突變型別以插入缺失較為多見。
SD site
邊緣1-2bp位置發生的點突變有c.3028+1，c.3028+2可直接判定為MET 14號外顯子跳躍突變，例如c.3028+1G>A，c.3028+1G>T，c.3028+2T>A等。除經典剪接序列外，供體位點c.3028的鹼基替換（例如：c.3028G>A，對應氨基酸改變為p.D1010N；c.3028G>C對應氨基酸改變為p.D1010H等），c.3028+3的鹼基替換也曾被報道為MET 14號外顯子跳躍突變[2][3]。同樣累及該區域的插入/缺失也可導致MET 14號外顯子跳躍突變，例如c.3018_ c.3028+8del。發生在該區域的突變型別以點突變較為多見。
另一類是基因變異累及內含子上的BS和PPT區域，多為發生在緊鄰剪接受體位點上游約25bp的內含子非編碼區的鹼基替換和插入缺失突變，如上圖5A所示。此類變異可能會導致RNA無法完成正常的剪接過程，故而通常會被認可導致MET 14號外顯子跳躍突變。這類MET 14號外顯子跳躍突變的判定主要來自文獻報道[4]。
BS位點
上的A鹼基與RNA剪接過程中的親核攻擊有關，其核苷酸位置在如圖5A所示的c.2888-29（即內含子-29位點）。若缺失的部分包含該區域，則可能導致MET 14號外顯子跳躍突變。
PPT位點
是RNA剪接過程中剪接因子相關蛋白與分支位點結合蛋白（SF1）相互作用的區域。其核苷酸位置在如圖5A所示的c.2888-24_2888-9（即內含子-24_-9區域）。若缺失的部分涉及該區域，也可能導致MET 14號外顯子跳躍突變。
此外，外顯子14上發生的Y1003突變和部分缺失突變，不會干擾正常的剪接機制，即不會導致外顯子14的錯誤剪下，但因為最終也可以導致MET降解減少、下游訊號的持續啟用，此時也會被報告為MET 14號外顯子跳躍突變。
NGS測序過程中實際檢出的變異往往會跨越多個區域影響RNA剪接，如c.2888-35_2888-17del，這個變異導致內含子-35_-17的區域發生了缺失，影響了BS以及部分PPT區域。c.2888-35_2888del這個變異不僅影響了BS位點、PPT區，還影響了剪接受體位點。這些突變都可能導致MET 14號外顯子跳躍突變。
圖6 剪接發生的基因組變異位置[4]
圖注：研究者在1141例肺癌患者中確定了28名非鱗狀NSCLC患者發生了MET突變。根據以上對於變異型別的分類，可將患者的MET突變分為圖中顯示的4類，其中有些患者的變異涉及多個區域。
不同型別的MET 14號外顯子跳躍突變的發生率如何？
2020年ASCO口頭彙報的一項針對MET 14號外顯子跳躍突變肺癌患者的研究中，作者透過對60495名非小細胞肺癌患者的樣本進行NGS雜交捕獲測序，在1387個樣本中檢測出MET 14號外顯子跳躍突變，包括>500種變異形式，這些突變根據累及的功能位點可分為：剪接供體位點（42%）、剪接受體位點（4.7%）、多嘧啶位點（15%）、剪接受體和多嘧啶位點（13%）、D1010（23%）、Y1003（2.1%）和全外顯子缺失（0.3%）。
圖7 非小細胞肺癌樣本中的MET 14號外顯子跳躍突變事件分佈[5]
怎麼針對報告進行MET 14號外顯子跳躍突變的報告解讀?
第一步：看數字。突變是否發生在外顯子14邊緣，即c.2888，-1/-2和c.3028，+1/+2/+3附近。如果看到c.2942和c. 3082也別先否定，確認轉錄本資訊, 若為NM_001127500.3，也為外顯子14前後。
第二步：看變異。剪接位點邊緣的點突變或缺失是否影響剪下（主要看c.）。
第三步：看範圍。若變異中不包括2888/3028等數字，需判斷髮生變異區域是否包含SA、SD、BS、PPT等功能區域。如BS，c. 2888-29， PPT c. 2888-24_c. 2888-9，以及SA、SD區域。
比如，c.2888-35_2888-17del這個變異, 影響了BS區域（c.2888-29）以及部分的PPT區域（c.2888-24_c.2888-17），推測為MET 14號外顯子跳躍突變。
再比如，c.3020-c.3038+24del, 缺失範圍包括了SD區域，c.3028以及c.3028+1_c.3028+3，也推測為MET 14號外顯子跳躍突變。
第四步：如果是外顯子14上的點突變或缺失，不能輕易下結論。
注：可導致MET 14號外顯子跳躍突變的突變位置多樣化且變異型別多樣化，目前已報道超過500種變異可導致MET 14號外顯子跳躍突變，並且仍有新的位點被報道。如檢測到的突變未查詢到相關文獻報道，或未累及上述經典區域，判斷是否發生MET 14號外顯子跳躍突變，最終需要透過其他檢測方法來驗證，通常認為RNA水平的檢測是比較好的驗證方法，例如RNA NGS和實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR）等。
回到一開始的檢測報告，現在你能知道哪個才是MET 14號外顯子跳躍突變了嗎？
專家簡介
應建明 教授
國家癌症中心/中國醫學科學院腫瘤醫院病理科主任，主任醫師，教授，博士生導師
中國抗癌協會腫瘤病理專業委員會候任主任委員
中國抗癌協會腫瘤病理專業委員會分子協作組組長
中華醫學會病理學分會分子病理學組副組長
中國醫師協會病理醫師分會分子病理委員會副主任委員
中國研究型醫院學會超微及分子病理專委會副主任委員
中國研究型醫院學會病理學專委會副主任委員
國家腫瘤質控中心單病種質控專家委員會委員
國家抗腫瘤藥物臨床應用監測專家委員會委員
國家藥品監督管理局醫療器械技術評審專家諮詢委員會委員
中國合格評定國家認可委員會CNAS認可評審專家、評定專家
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正確答案：
1、ABCD
2、A
參考文獻：
[1] [PMID: 27009743] Drilon, Alexander. “MET Exon 14 Alterations in Lung Cancer: Exon Skipping Extends Half-Life.” Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research vol. 22,12 (2016): 2832-4. doi:10.1158/1078-0432.CCR-16-0229.
[2] [PMID: 34295201] Fujino, Toshio et al. “Lung Cancer with MET exon 14 Skipping Mutation: Genetic Feature, Current Treatments, and Future Challenges.” Lung Cancer (Auckland, N.Z.) vol. 12 35-50. 20 May. 2021, doi:10.2147/LCTT.S269307.
[3] [ PMID: 25971938] Frampton, Garrett M et al. “Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors.” Cancer discovery vol. 5,8 (2015): 850-9. doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0285.
[4] [PMID: 26729443] Awad, Mark M et al. “MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression.” Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology vol. 34,7 (2016): 721-30. doi:10.1200/JCO.2015.63.4600.
[5] Awad, M. et al. “Characterization of 1,387 NSCLCs with MET exon 14 （METex14） skipping alterations （SA） and potential acquired resistance （AR） mechanisms.” Journal of Clinical Oncology 38 （2020）: 9511-9511.
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