前言
作為一種新型腫瘤免疫療法，嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法在臨床應用中備受矚目，該療法透過基因工程技術使T細胞能夠特異性識別腫瘤相關抗原，從而發揮抗腫瘤作用。CAR-T療法已在血液系統腫瘤的治療中取得了令人鼓舞的療效，多項研究發現，靶向CD19的CAR-T細胞在復發難治性急性B淋巴細胞白血病和大B細胞淋巴瘤中可發揮靶向殺傷作用，並可提供極高的緩解率（80%～90%）[1]。這一發現不僅證實了細胞免疫治療的臨床價值，同時也激發了臨床醫師對於其他腫瘤相關抗原和CAR-T療法應用於實體瘤的研究熱情，其中，發病率及死亡率均位居前列的肝細胞癌（HCC），即為關注熱點之一。
然而，與血液腫瘤中的成就相比，CAR-T療法在實體瘤中的應用仍面臨著諸多問題，這其中，治療靶點的選擇是最為嚴峻的挑戰之一。首先，不同於CD19僅表達於B細胞，實體瘤相關的腫瘤抗原往往不僅表達於腫瘤組織，在正常組織中亦可有低水平的表達，部分抗原甚至還有維持組織正常生理功能的作用。因此在實體瘤中，CAR-T細胞在清除表達相應抗原的腫瘤細胞的同時，也可能攻擊表達相同抗原的正常組織。CAR-T細胞可在非腫瘤組織中因接觸抗原而被啟用、增殖，然後釋放大量炎性因子而導致區域性臟器的免疫損傷甚至誘發細胞因子風暴，引發嚴重甚至致死性不良事件（AE）[1]。
其次，異質性是實體腫瘤的特點之一，即使是同一位患者一個部位的腫瘤，也並非均表達相同的腫瘤相關抗原。因此，如果只用一種單靶點的CAR-T細胞治療實體腫瘤，那麼理論上實體瘤高度異質性的特點就決定了其必然會復發或無法根除[1]。
因此，實體瘤的種種特點決定了CAR-T治療在實體瘤中的應用必然道阻且長，而面對種種挑戰，目前也已有多項臨床研究進行了評估與探索。本文將聚焦於HCC，總結目前CAR-T治療HCC的靶點，並對相關的臨床研究做簡要歸納。
HCC中的CAR-T療法靶點
Glypican-3（GPC3）
GPC3是硫酸乙醯肝素蛋白聚糖家族的成員，在HCC中高表達，而在正常肝組織中不表達或低表達。有研究證實，GPC3的表達與HCC的進展相關，約72%的HCC患者表達GPC3，53%的HCC患者血清GPC3表達水平顯著升高[2]。
上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院所開展的兩項連續的I期研究對GPC3 CAR-T療法在HCC中的應用進行了探索，研究共納入13例晚期HCC患者，3年、1年和6個月總生存（OS）率分別為10.5%、42.0%和50.3%，其中1例患者在44.2個月後仍存活。9例患者發生細胞因子釋放綜合徵（CRS），其中8例為1-2級，1例為5級，未發生3級或4級神經毒性[3]。其他數項評估GPC3 CAR-T單獨治療或聯合免疫檢查點抑制劑或聯合抗血管生成藥物在HCC中療效與安全性的研究正在進行中[2]。
甲胎蛋白（AFP）
AFP是一種分泌性糖蛋白，具有一系列重要的生理功能，包括轉運功能、免疫抑制、凋亡誘導等[2]。甲胎蛋白在胎兒血液迴圈中具有較高的濃度，出生後則下降，至生後2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中較難檢出，故在成人血清中含量極低，然而當成人發生HCC時，AFP會重新表達。
一項I期開放標籤研究（NCT03349255）正在評估ET1402L1-CAR T細胞在轉移性HCC患者中的安全性和有效性，該研究的前期試驗已證實ET1402L1-CAR T細胞可特異性結合AFP蛋白表達陽性的HCC細胞並將其裂解，並在動物模型中確認了該細胞在腹膜內HCC異種移植模型中的抗腫瘤活性[4]。
另一項評估AFPᶜ³³²T細胞在AFP+ HCC患者或其他腫瘤患者中應用的I期多中心開放標籤研究（NCT03132792）也正在進行中，研究預計納入45例患者，將評估不同的細胞劑量水平以確定最佳耐受劑量範圍，並進一步確定該療法的安全性和有效性。
c-Met
c-Met是由Met原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體，可透過與肝細胞生長因子（HGF）結合而啟用下游的MAPK、PI3K和STAT3通路，進而誘導細胞的生長、增殖、遷移、侵襲等一系列生物學效應。研究表明，c-Met的過表達可以促進HCC的進展[2]。因此，c-Met被認為是治療HCC的潛在靶點。
目前，第二代和第三代c-Met CAR-T細胞已製備成功，證實c-Met CAR-T細胞可以特異性殺死HCC細胞[2]。南京醫科大學附屬第二醫院團隊製備了靶向c-Met和PD-L1的CAR-T細胞，並證明雙靶點CAR-T細胞對c-Met+PD-L1+ HCC細胞具有特異性的細胞毒性[5]。該團隊進一步設計了c-Met/PD-L1 CAR-T細胞用於原發性HCC患者的單中心臨床研究（NCT03672305），研究計劃納入50例患者，主要終點為透過OS評估該療法的療效。
Mucin 1（MUC1）
MUC1是一種跨膜糖蛋白，定位於正常上皮細胞的頂膜，在部分上皮惡性腫瘤和血液惡性腫瘤中過度表達。研究證實，MUC1/JNK/TGF-β訊號通路促進了肝癌細胞的遷移和侵襲[2]。因此MUC1被認為是HCC的潛在治療靶點之一。
已有團隊構建了第一代和第三代的MUC1 CAR-T細胞，且證實其均能特異性殺死MUC1高表達的HCC細胞，而MUC1低表達的正常肝細胞則幾乎未受損[2]。目前，兩項評估MUC1 CAR-T細胞治療HCC等腫瘤的臨床試驗正在進行中（NCT02587689、NCT02839954）。
上皮細胞粘附分子（EpCAM）
EpCAM是一種跨膜糖蛋白，在包括HCC在內的多種腫瘤中高表達。既往研究顯示，EpCAM陽性的HCC細胞表現出自我更新和分化等肝臟幹細胞樣特徵，這影響了HCC的生長和侵襲[2]。由於EpCAM陽性的HCC預後較差且復發風險較高，因此EpCAM已被確定為HCC的早期生物標誌物和治療靶點。
一項單臂II期多中心研究（NCT02729493）正在評估靶向EpCAM的CAR-T療法在復發或難治性肝癌中的療效和安全性，研究納入患者25例，主要終點為疾病控制率（DCR）。另一項I/II期單臂研究（NCT03013712）評估了EpCAM CAR-T療法在包括肝癌在內的多種EpCAM陽性腫瘤患者中的應用，研究共納入60例患者，主要終點為EpCAM CAR-T療法的毒性。
CD133
CD133是另一種跨膜糖蛋白，在HCC、腦腫瘤、肺癌和胰腺癌中高表達[2]。CD133被認為是腫瘤幹細胞（CSCs）的標誌物，其在腫瘤的生存、增殖、轉移和復發中起重要作用。既往研究顯示，CD133細胞不存在於非癌性肝組織中，而僅存在於HCC組織中，且其在HCC細胞中的表達可誘導HCC細胞的生長和轉移[2]。由於研究顯示CD133高表達的HCC患者總生存率較低且複發率較高，因此，CD133被認為是CD133陽性HCC患者免疫治療的分子靶點。
之前有研究團隊構建了CD133特異性CAR-T細胞（CART-133），並發現CART-133細胞具有較強的細胞裂解能力，並可顯著抑制體內腫瘤生長[2]。隨後，該團隊進行了一項開放標籤單臂I/II期臨床試驗（NCT02541370），以評估CART-133細胞對晚期HCC等癌症患者的抗腫瘤作用。該研究I期納入23例患者，包括14例HCC患者，其中9例患者病情穩定，6個月疾病控制率為43%[6]。該研究的II期階段共納入21例HCC患者，患者中位OS為12個月（95%CI，9.3-15.3個月），中位無進展生存期（PFS）為6.8個月（95%CI，4.3-8.4個月）。1例患者達到部分緩解（CR），14例達到疾病穩定（SD）。患者發生3級貧血2例，3級高膽紅素血癥4例，未見4級AE[7]。
CD147
CD147是一種I型跨膜糖蛋白，已被發現在80%的HCC病例中高表達，CD147可以透過刺激基質金屬蛋白酶的分泌來促進腫瘤的進展、侵襲和轉移。另有報道顯示，CD147的表達與HCC的侵襲行為和預後不良有關。目前，一種新型131I標記的CD147特異性單克隆抗體已經制備，與射頻消融（RFA）或經導管動脈化療栓塞（TACE）聯合可用於治療HCC[2]。這些發現表明，針對CD147的靶向治療或可成為HCC的新治療選擇。
一項開放標籤單臂I期研究（NCT03993743）評估了CD147靶向CAR-T細胞用於晚期HCC患者的安全性和臨床活性。該研究預計納入34例晚期HCC患者，主要終點為CD147 CAR-T導致的AE的發生率和型別。
自然殺傷細胞2族成員D（NKG2D）
NKG2D是一種II型跨膜糖蛋白，其配體（NKG2DL）在包括HCC在內的多種腫瘤中表達，但在正常組織中不表達[2]。MHC I鏈相關分子A和B（MICA和MICB）和六種鉅細胞病毒UL16結合蛋白（ULBP1-6）是人類NKG2DL的兩個家族。已有研究表明，MICA、MICB、ULBP1在人類HCC中大量表達，此外，肝切除術後的早期復發與ULBP1的表達缺失密切相關，MICA、MICB的低表達通常表明腫瘤進展的風險顯著增加。因此，NKG2DL可成為HCC免疫治療的分子靶點。
已有研究團隊構建了在HCC細胞上靶向NKG2DL的新型NKG2D-BBz CAR-T細胞。研究顯示，NKG2D-BBz CAR-T細胞可特異性裂解高表達NKG2DLs的HCC細胞，但不影響NKG2DLs陰性細胞系。結果表明，NKG2D-BBz CAR-T細胞在體外和體內均可以有效消除NKG2DL高表達HCC細胞，從而為NKG2DL陽性HCC患者提供可能的新治療選擇[8]。
癌胚抗原（CEA）
CEA是一種糖基化磷酯醯肌醇（GPI）錨定蛋白，在大多數人類腫瘤中CEA表現為過表達，目前未見將CEA作為原發性肝癌治療靶點的相關研究，但CEA與肝轉移之間的相關性可作為抗癌治療的生物標誌物[9]。然而，一致性的缺乏和嚴重的不良反應限制了第一代抗CEA CAR-T細胞在肝轉移中的應用。為了提高抗CEA CAR-T細胞的耐受性和永續性，一項開放標籤單臂I期研究對第二代CAR-T細胞的肝動脈輸注策略進行了評估（NCT01373047），研究納入8例伴肝轉移的胃腸道腫瘤患者，1例患者存活超過23個月，沒有患者發生與CAR-T輸注治療相關的3級或4級AE[10]。
多靶點
基於提高CAR-T細胞識別特異性的目的，製備靶向兩種或多種抗原的CAR-T細胞也是治療思路之一[2]。如之前所述，南京醫科大學附屬第二醫院團隊對c-Met和PD-L1雙靶點CAR-T細胞的療效進行了評估（NCT03672305）。
而除此之外，另有研究針對HCC製備了共表達GPC3和肝組織特異性蛋白1（ASGR1）的雙靶點CAR-T細胞。體外實驗表明，當與GPC3+ASGR1+腫瘤細胞共培養時，與單靶T細胞相比，雙靶T細胞可產生更高水平的白介素2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-4。此外，雙靶點CAR-T細胞可顯著抑制小鼠中GPC3+ASGR1+ HCC腫瘤異種移植物的生長，而在單抗原或雙抗原陰性腫瘤異種移植物中未觀察到顯著的生長抑制[11]。
總結
儘管CAR-T療法在血液系統惡性腫瘤的治療中取得了令人矚目的成果，但由於實體瘤治療中嚴重的脫靶效應和實體瘤自身的異質性特點，CAR-T療法在實體瘤中的研究和應用還有很長的路要走。需要強調的是，作為治療難度最高的惡性實體瘤之一，CAR-T療法在HCC中的應用仍多處於臨床前研究和早期臨床研究階段。但儘管困難重重，HCC中的CAR-T療法仍然值得期待，多項基於上述靶點的臨床研究也正在進行中。我們有理由相信，在未來運用CAR-T細胞對腫瘤進行精確、多靶點更替式的打擊可能會改變HCC的治療策略，為患者提供更多的積極治癒選擇。
參考文獻
[1] 劉洋,朱宏麗,韓為東. CAR-T細胞治療實體瘤的挑戰與思考[J]. 中國腫瘤臨床,2017(9).
[2] Guo J, Tang Q. Recent updates on chimeric antigen receptor T cell therapy for hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Gene Therapy, 2021, 28(10): 1075-1087.
[3] Shi D, Shi Y, Kaseb A O, et al. Chimeric antigen receptor-glypican-3 T-cell therapy for advanced hepatocellular carcinoma: results of phase I trials[J]. Clinical Cancer Research, 2020, 26(15): 3979-3989.
[4] Liu H, Xu Y, Xiang J, et al. Targeting alpha-fetoprotein (AFP)-MHC complex with CAR T cell therapy for liver cancer[J]. Clinical Cancer Research, 2016:1078-0432.CCR-16-1203.
[5] 李濤, 蔣偉, 顧璇,等. 全人源雙特異性c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白的最佳化,製備及生物學特性鑑定[J]. 南京醫科大學學報(自然科學版), 2019(10).
[6] Wang Y, Chen M, Wu Z, et al. CD133-directed CAR T cells for advanced metastasis malignancies: A phase I trial[J]. Oncoimmunology, 2018, 7(7): e1440169.
[7]Dai H, Tong C, Shi D, et al. Efficacy and biomarker analysis of CD133-directed CAR T cells in advanced hepatocellular carcinoma: a single-arm, open-label, phase II trial[J]. Oncoimmunology, 2020, 9(1): 1846926.
[8]Sun B, Yang D, Dai H, et al. Eradication of hepatocellular carcinoma by NKG2D-based CAR-T cells[J]. Cancer immunology research, 2019, 7(11): 1813-1823.
[9]Zhang L, Ding J, Li H Y, et al. Immunotherapy for advanced hepatocellular carcinoma, where are we?[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Cancer, 2020, 1874(2): 188441.
[10] Katz S C, Burga R A, McCormack E, et al. Phase I hepatic immunotherapy for metastases study of intra-arterial chimeric antigen receptor–modified T-cell therapy for CEA+ liver metastases[J]. Clinical cancer research, 2015, 21(14): 3149-3159.
[11] Chen C, Li K, Jiang H, et al. Development of T cells carrying two complementary chimeric antigen receptors against glypican-3 and asialoglycoprotein receptor 1 for the treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer immunology, immunotherapy: CII, 2017, 66(4): 475-489.
