伯科高品質DNA合成技術實現多平臺靶向測序應用的領先水平

Target Capture-Seq（TargetCap）靶向捕獲測序是一種平臺型技術，最初是被作為一種更經濟的目標基因的研究方法，經過10餘年的發展，TargetCap逐步走向實踐，廣泛應用於輔助生殖、遺傳病篩查診斷、腫瘤防治、病原檢測、農業分子育種等領域。TargetCap基於核酸雜交原理，實驗體系穩定，適用範圍廣，可以用於病毒、植物和動物基因組目標區域捕獲；同時，其覆蓋區域大小靈活，小至24Kb，用於ctDNA負荷監控[1]，大到Mb級別，比如涵蓋近兩萬個基因的全外顯子區域。現在，TargetCap已經成為高通量測序應用轉化中使用最為廣泛的技術之一（圖1）。那麼，如何才能充分實現TargetCap技術的優勢呢？

圖1. 伯科TargetCap液相基因晶片廣泛應用

TargetCap的技術核心是液相基因晶片，它由序列不同的生物素修飾探針組成，探針複製數的均一性是其效能關鍵。按照生產工藝不同，可以分為直接合成與間接製備兩類（圖2），直接合成以長鏈ssDNA探針為代表，其優勢是無後續處理過程，探針複製數均勻，批間穩定性好、特異性強、均一性優異。在低密度晶片中，兩種路線的表現差異不大，而高密度晶片（如WES Panel）對間接製備探針的複製數均一性具有一定挑戰。

圖2. 液相基因晶片合成路線示意圖

單單隻有基因晶片還不夠，想要充分發揮TargetCap的功能，還需要好的“生態”，優秀的雜交緩衝液體系對捕獲至關重要（圖3）。現在，以磷酸緩衝液為基礎的雜交體系已逐漸被放棄，Na離子濃度和輔助試劑尤為重要，它們能夠提高Low-GC區域的親和力，開啟High-GC二級結構，使整個雜交反應更加均勻。伯科TargetCap Hybridization and Wash Kit擁有自主智慧財產權，效能卓越，提供定製化服務，比如自動化流程需要個別組分增量。此外，接頭阻斷劑（Universal Blockers）必不可少，Universal Blockers主要用於防止接頭序列串聯，提高中靶率（On-Target），增加資料有效性。

圖3. 伯科TargetCap捕獲試劑體系

由於技術原理的限制，NGS技術或多或少的存在著一些偏好，例如PCR導致AT-rich區域覆蓋不佳，研究人員就透過針對性的PCR-free技術來降低這些偏好，更真實的還原基因組。同樣，TargetCap技術也有偏好，例如，由於結合長度降低導致親和力不足所造成的目標區域上下游覆蓋降低的“邊緣效應”，這個現象在短Insert文庫中將會被放大，比如cfDNA；此外，還有InDel變異導致探針對突變片段的捕獲能力降低等現象。MSI由於多型性的存在，其覆蓋往往具有類似InDel變異的現象，如圖4所示，透過增加側翼探針設計，可以明顯改善MSI位點覆蓋和InDel變異檢測。因此，除了晶片、Buffer和Blockers三個關鍵因素，還需要優秀的探針設計助力，真正讓TargetCap捕獲基因組“最初的模樣”。

圖4. 探針設計對覆蓋及變異檢測的影響

伯科TargetCap 靶向捕獲平臺的液相基因晶片採用直接合成，擁有自主研發的合成平臺，建立了以100+萬真實合成探針為基礎的智慧化探針設計平臺，配備高效能雜交緩衝液、Universal Blockers，擁有200+ Panel設計合成專案經驗，適合多物種、多組學、多平臺靶向測序研究，效能卓越，批次穩定。值得一提的是，TargetCap提供的NGS功能驗證檢測，為使用者的產品開發節省了寶貴時間，受到廣泛好評（圖5）。

圖5. 伯科TargetCap靶向捕獲技術平臺

此外，伯科還為NGS應用開發了相應的高品質核酸產品-UltraPu Oligos，交叉汙染可控制在0.05%以內，提供個性化規格，例如不等比混樣等，適合多重PCR引物池，Index引物，UMI接頭合成開發（圖6）。

圖6. 伯科UltraPu DNA Oligos合成技術

全外顯子Panel的效能是檢驗捕獲體系的“試金石”，伯科人類全外顯子液相基因晶片TargetCap Core Exome Panel v3.0（BOKE v3.0）全流程國產化設計生產，包含約40萬條120nt ssDNA探針。自2020年9月推出以來，經過一年多的使用者測評與使用，其效能表現獲得高度認可。第三方獨立分析顯示，在中靶率相當的前提下，BOKE v3.0覆蓋均一性引數Fold80可達到＜1.4的頂尖表現，從眾多同類產品中脫穎而出，在TMB、MRD檢測中具有明顯優勢。除效能優異之外，BOKE v3.0 WES可靈活新增其他探針模組，配備高通量流程，耐受短時間雜交，同時測序平臺相容性好，更詳細的資料表現請參考圖7。

圖7. 全流程國產化開發的人類全外顯子液相基因晶片TargetCap Core Eoxme Panel v3.0

全外顯子晶片（WES Panel）開發的初衷是從整個基因組中富集可能直接導致蛋白變異的編碼區進行測序檢測，有效節約測序成本。隨著MRD研究深入，WES Panel被賦予了另一種用途-間接保證ctDNA檢測靈敏度。MRD在實體瘤治療管理中的價值越來越受到重視，由於cfDNA複製數有限，追蹤少量SNV無法匹配MRD的檢測要求，即實現≥0.02% ctDNA檢出；多項研究表明，透過增加追蹤SNV數量可有效提高ctDNA檢出率（圖8），不過，腫瘤攜帶的變異位點有限，還要經過篩選過濾，WES測序提供了更加充足的候選突變位點選擇。

圖8. 充足的突變位點候選是MRD檢出的潛在保障

正因如此，基於WES Panel的“Tumor-Informed”思路順理成章的受到研究人員的青睞。與此同時，特殊的應用場景也使得MRD對檢測技術的要求更加嚴苛。基於個體突變圖譜的ctDNA檢測具有前所未有的個性化特徵，固定Panel很難完美覆蓋每一位患者的待追蹤位點，理論上針對性的個體定製是最好的解決方案，但同時要滿足MRD時效性要求，快速合成個性化位點Panel；監測超低頻突變必須開展超深度測序，Panel過大，患者負擔增加，個體特有的克隆性造血背景突變還需要配對白細胞進行“生物學降噪”，檢測成本進一步增加，需要精簡MRD Panel控制檢測成本。總體來看，MRD的研究與開發需要完善的捕獲體系和極速探針合成平臺等底層技術支撐。

圖9. 伯科對“袖珍”Panel的開發可行性測試

依託完備的靶向捕獲產品線與自主合成平臺，伯科將為MRD研究轉化提供高品質上游助力而持續努力，包括，1）高效能WES Panel，可根據使用者需要快速定製模組探針，篩選充足的腫瘤監測位點；2）“袖珍”Panel合成，具有樣本Tracking功能、涵蓋I/II變異位點，作為個性化位點的“Carrier”；3）個性化位點Panel合成，≥3個工作日極速週期，加速研發；4）個性化多重PCR引物池合成；此外，5）高效能UMI接頭，長度、數量適中，效率均勻，編輯距離大，錯位構成，測序準確；6）超純Index Primer，低於0.05%的引物間交叉汙染率保證樣本拆分準確性；7）高效能雜交緩衝液，突變和片段長度耐受度高，背景突變低，適合cfDNA低頻突變檢測。透過鹼基修飾和反應體系等技術細節的調整，我們相信液相基因晶片的突變檢測效能還能進一步提升。

圖10. 伯科為MRD研究轉化提供底層技術支撐

MRD的應用需求包括準確性、個性化、時效性、經濟性等，對上游原料供應，Assay研發，以及臨床轉化都提出了前所未有的挑戰，同時，這也凸顯了核心技術和完備產線的國產化意義。從合成路線摸索，到合成工藝概念驗證，再到工業化生產和完備的質量體系建立，伯科穩步前行，現在，伯科已經建立了完整的國產化液相基因晶片合成產品線。在無錫市政府部門的幫助和支援下，伯科已經在錫東建成了國內最大的液相基因晶片生產基地和應用示範中心並投入使用。在這裡，由衷的感謝企業和政府對伯科發展的幫助。

隨著生物學和臨床研究的深入，靶向測序作為平臺型技術，必將迎來更多的應用場景，發揮更大的作用。伯科立足於國內，縮短供貨週期和成本，為研究人員提供高品質核酸產品的同時也提供高品質服務，積極滿足下游應用端的需求，伯科人將繼續努力，真正踐行“精益求精創新，為人類美好生活”的企業使命。

參考文獻

[1] Zhu G, Guo Y A, Ho D, et al. Tissue-specific cell-free DNA degradation quantifies circulating tumor DNA burden[J]. Nature communications, 2021, 12(1): 1-11.

關於伯科

伯科生物科技有限公司是一家合成生物學底層技術領軍企業，致力於面向合成生物學與基因組學的新技術開發與轉化，於2020年獲得國家高新技術企業認證。為學術研究與商業應用提供了高品質核酸產品，為醫療健康、生物製藥和農業等領域提供底層技術支援。公司產品線涵蓋NGS測序、奈米孔測序、PCR平臺檢測、CRISPR基因編輯、以及RNA干擾等領域。

伯科生物已在中國無錫搭建全流程國產化的高通量核酸合成與應用技術轉化中心，建立了GMP廠房和ISO9001、ISO13485質量體系。公司已經為國內外100多家的醫學檢驗機構、30多家知名醫院與臨床學術團隊開發了100多款液相基因晶片（Gene Panel），在基因組、轉錄組、甲基化組及病原體液相基因晶片均有成熟的產品。

液相基因晶片（Gene Panel）已經成為合成生物學的重要應用之一，在生殖、遺傳疾病、腫瘤診斷、腫瘤早篩、病原體檢測等醫學與健康領域有著廣泛的應用，在動植物的分子育種以及品種鑑定方面也有著廣闊的應用前景。2020年9月伯科生物在液相基因晶片取得突破性進展，完成了首款全流程國產人全外顯子液相基因晶片的研發與測試，正式推向市場，達到了國際領先水平，打破了海外巨頭對該產品的壟斷。該產品在實現優質效能的同時實現了模組化擴充套件，擴大全外顯子液相基因晶片在科研、臨床、大健康等領域的應用。伯科生物是國內唯一提供全流程國產甲基化液相基因晶片的公司。

未來，依託合成生物學的底層技術，伯科生物將向基因治療、核酸藥物、DNA儲存、DNA材料學以及分子育種等領域積極拓展，為實現“精益求精創新，為人類美好生活”的企業使命而努力。