今天推送的文章發表在ACS Catalysis的“Discovery of a P450-Catalyzed Oxidative Defluorination Mechanism toward Chiral Organofluorines: Uncovering a Hidden Pathway”，通訊作者為通訊作者為湖南師範大學化學化工學院化學生物學與中藥研究教育部重點實驗室、湖南省植物化學研究與開發重點實驗室的王健博教授。
由於氟取代化合物所具有的獨特的化學和物理性質，有機氟已廣泛應用於藥物、農用化學品、材料和用於能量轉換的化合物中。然而，由於強碳氟 (CF) 鍵 (130 kcal/mol)，有機氟的降解非常具有挑戰性。自然界中有機氟，特別是全氟和多氟烷基化合物（PFCs）的泛濫和積累，對生態環境和人類健康構成了嚴重威脅。為了實現有機氟的降解，已經開發了多種方法，包括化學降解和生物降解。研究發現 P450s 能夠催化某些氟烷烴、氟芳烴甚至含氟大分子藥物的氧化脫氟。
目前已有由 P450 催化的各種氧化脫氟程式的報道，但機理研究主要集中在氟化芳族化合物的脫氟上。P450 催化的氟化芳烴氧化脫氟涉及 FeIV=O (Cpd I) 對底物的親電攻擊，瞬態陽離子中間體的形成和重排，以及作為最終 Fe-O 鍵斷裂的醌和氟離子釋放的產生（方案 1a）。在還原劑的存在下，醌可以進一步還原為酚類產物，例如對苯二酚。在這個經典模型中，P450催化的氧化脫氟都發生在非手性中心，未見在手性中心發生氧化脫氟的報道。已知此類化合物具有特殊的化學和物理特性。因此，揭示這種情況下特定的 P450 催化的脫氟過程對於瞭解基於有機氟的治療藥物的體內代謝和自然界中含氟汙染物的降解是必要的。
在本研究中，作者報告了P450-BM3啟用的兩種不同的氧化脫氟路線（方案1b）。除了涉及α位羥基化誘導的脫氟的正常脫氟途徑外，還發現了一種不尋常的脫氟途徑，即發生在苯環的遠端羥基化。另外發現 P450-BM3 在導致的遠端芳烴羥基化脫氟過程中對R型底物表現出高立體選擇性。
P450-BM3對底物1的脫氟反應
之前的研究證明α-氟苯乙酸是研究氟乙酸脫滷酶催化機制良好的底物。據報道， P450-BM3催化它缺氟的類似物苯基乙酸乙酯發生α位點羥基化，並具有高對映選擇性。在前人研究的基礎上，選擇α-氟代苯乙酸酯作為探針研究P450-BM3催化的手性有機氟氧化脫氟反應。由於手性氟中心位於α位，反應的對映選擇性可能不同。圖 1a展示了可能的α 位羥基化過程。為了研究這種有趣的化學反應，作者測試了含有 P450-BM3 的全細胞對底物 1 的反應性。GC 分析檢測到兩種產物（圖 1b），表明P450-BM3能夠催化1進行脫氟。使用純化的 P450-BM3 也得到相同的結果（圖 1b）。GC-MS分析證明這兩種產品分別是扁桃酸乙酯（(R)-2；ee >91%）和 2-（2-羥基苯基）乙酸乙酯（產物3）。這與常見的氧化脫氟路線不符，表明存在一種新的機制。動力學資料（kcat= 3.43±0.53 s-1，Km= 11.17±4.53 mM，TOF = 160 min-1，和 TTN = 909）和耦合效率（30.1%）說明P450-BM3 對模型反應具有適度的催化活性。
探索具體反應過程
為了更好地分別揭示具體的反應過程，作者首先嚐試構建增強化學選擇性的突變體。由於已報道變體 F87A 可增加 2-苯乙酸酯的 α-羥基化活性，因此測試了其對底物1的活性，結果反應體系中僅檢測到產物2。為了進一步研究產物2的生成過程，透過GC在時間尺度上監測純化的F87A 催化反應。如圖 2a 所示，脫氟步驟非常快，反應一開始就形成中間體4。0.5 h後，4迅速積累並開始形成產物2。隨著反應時間的延長，4逐漸減少，2逐漸增加。結果說明1的直接脫氟產物是 2-氧代-2-苯基乙酸乙酯 (4)，然後經過額外的還原步驟生成 2。葡萄糖脫氫酶 (GDH) 是最有可能參與還原步驟的還原酶。據報道它可以催化C=O和C=N鍵的還原。為了證明這一假設，用純化的GDH對4的進行測試。結果表明，4被具有高R選擇性（ee > 88%）的GDH完全還原為2（圖 2b）。
由於α-羥基化產物5是一種轉瞬即逝的手性中間體並且難以直接檢測，作者轉向計算研究以獲取有關產物5到4自發轉化的一些線索（圖 1a）。由於缺乏關於中間體5絕對構型的資訊，作者使用 Gaussian 16分別對 (S)-5(S-RC1) 和 (R)-5(R-RC1)進行混合簇連續 (HCC) 模型計算。圖3顯示了從中間體5到中間體4的脫氟過程計算的相對自由能曲線。對於(S)-5，自由能壘僅為11.8 kcal/mol；在 (R)-5 的反應中發生了類似的過程，自由能壘為11.0 kcal/mol 。兩個能壘都非常低，表明在這些反應中從5到4的轉化是快速和自發的。
為了構建僅產生產物3的突變體，應用了基於半合理飽和誘變的定向進化，在20個不同殘基上進行 NNK單密碼子飽和誘變文庫的構建和篩選。但沒有觀察到具有改進催化特性的突變體，這可能是由於體外實驗缺乏對不穩定的去飽和中間體7具有高活性的特殊還原酶，因此，無法篩選產生產物3（方案1b）所需的優良突變體。P450催化的苄基環羥基化似乎在脫氟中起關鍵作用。根據3的結構，推測反應過程同樣涉及P450催化的羥基化和額外的還原步驟。如圖4a所示，P450-BM3首先催化苯環鄰位羥基化生成6，然後遠端鄰位羥基誘導C-F鍵斷裂，形成中間體7。最後，類似於5的情況，7可能會被GDH樣還原酶進一步還原為3。
因為6和7的穩定性差，無法在WT型 P450-BM3 催化1的過程中捕獲中間體 6和7。因此選擇結構與底物 1 相似的苯基乙酸乙酯來間接揭示1→6的過程。作者推測，如果P450-BM3能夠催化1的芳香羥基化併產生6，那麼苯乙酸乙酯應該與P450-BM3進行催化生成對應產物。結果在該反應中，以高S選擇性生成扁桃酸乙酯 (2)，並且很容易檢測到穩定的芳香族羥基化產物3。這表明在P450-BM3 催化1的反應模型中可能會產生中間體6。作者合成了6的O-甲基化類似物以透過去甲基化和透過用AlCl3和乙硫醇處理的親核反應模擬脫氟過程來說明自發脫氟過程6→7（圖4b）。作者推測，如果8在去甲基化後可以自發生成7，那麼7應該很容易受到乙硫醇的親核攻擊以生成穩定的產物 9。實驗結果透過 NMR光譜證實了9的產生。
由於中間體6和7a不穩定且商業上無法獲得，作者採用同位素摻入實驗來闡明還原步驟（圖 4c）。當使用基於D2O的緩衝液時，觀察到19%的氘摻入，但當使用d-葡萄糖原位生成 NADPD時，氘摻入高達67%，且氘摻入均發生在α位點。這些結果表明NADPH作為主要的氫原子供體使C=C的還原成為可能。
與全細胞系統相比，純化的GDH催化形成3的產量較低，可能細胞內的另一種還原酶也可以催化這種還原。因此將全細胞或不含GDH的大腸桿菌裂解物與純化的P450-BM3 混合並用於轉化1，結果確實生成了3。由於具有烯還原(ene-reduction)活性，NemA是最有可能負責產生3的還原酶。因此使用純化的NemA和P450-BM3 測試在脫氟反應中的反應性，結果檢測到產物3，但沒有發現2。總體反應性仍然很低，推測細胞中可能有兩種以上的酶參與還原步驟。為了進一步支援假設，作者進行了QM計算以研究轉換過程 6→7。圖5顯示了計算出的脫氟過程的相對自由能曲線，自由能壘高達20.2 kcal/mol，這與實驗資料非常吻合。
MD 模擬揭示P450-BM3的立體選擇性
根據觀察到的底物消耗，P450-BM3表現出對R型底物的偏好。然而，由於2-氟-2-苯基乙酸乙酯在水溶液中容易水解，因此很難驗證P450-BM3對(S)-1的活性。為了明確闡明該反應的立體選擇性，分別研究了P450-BM3對 (R)-1和 (S)-1的脫氟反應。(R)-1和(S)-1分別透過氟乙酸脫滷酶和P450-BM3的手性拆分製備，然後進行測試。(R)-1和 (S)-1的均可被P450-BM3催化生成2，但活性較低，在遠端誘導芳烴羥基化脫氟路徑中，P450-BM3對(R)-1有明顯的催化活性，而對(S)-1則無催化活性。P450 催化氧化脫氟的立體選擇性也透過 MD 模擬得到證實。如圖 S20 所示，殘基 Phe87、Thr260 和 Ala264位於底物(R)-1和 (S)-1的周圍，這將底物保持在所示的方向。作者首先研究了為何P450-BM3對α位羥基化無明顯選擇性。
在(R)-1和 (S)-1中，目標H原子和鐵氧O原子之間的距離 (D1)分別為3.07 和2.47 Å。在(R)-1和 (S)-1的整個MD模擬期間，D1值約為3 Å，這有利於Cpd I 的吸氫反應。因此 (R)-1和 (S)-1都會發生α-羥基化。其次，對於芳香族羥基化，反應開始於鐵氧代中間體 (Cpd I)的O原子對底物苯環中的目標C原子的攻擊。在(R)-1和 (S)-1中，目標 C 原子和鐵氧 O 原子之間的距離 (D2) 分別為 3.34 和 3.66 Å，很接近，但有兩個因素導致了立體選擇性：（1）目標 C 原子的 pπ 軌道的取向和（2）由(R)-1和 (S)-1在酶口袋的不同位置引起的空間位阻。對於 (R)-1 如圖 S20a 所示，鐵氧軸垂直於苯平面，使O原子的軌道與目標C 原子的 pπ 軌道有很大的重疊，這有利於CO鍵的形成。此外，O原子可以直接攻擊目標C原子而沒有任何空間位阻。對於 (S)-1，如圖 S20b 所示，鐵氧軸平行於苯平面，導致軌道重疊小得多，從而阻礙了 CO 鍵的形成。與目標C原子鍵合的H原子在O原子對C原子的攻擊過程中進一步發揮空間位阻，使 (S)-1 的芳族羥基化更加困難。
整理：樑子琦
文章連結：
https://doi.org/10.1021/acscatal.1c05510
