核心提示：為了解決葉片氣孔表型無損動態檢測這一技術瓶頸，華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室楊萬能教授團隊研發一種低成本、高通量葉片氣孔表型無損檢測新技術，並對不同玉米材料乾旱脅迫下的氣孔性狀差異及其潛在應用價值進行了深入研究。此外，團隊開發葉片氣孔表型分析入口網站供全球使用者免費開放使用，有助於未來作物大群體葉片氣孔動態表型分析和遺傳機制解析。
2021年10月30日，植物學知名期刊《Plant Biotechnology Journal》線上發表了華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室作物表型團隊題為“StomataScorer: A portable and high-throughput leaf stomata trait scorer combined with deep learning and an improved CV model”的研究論文。論文研發了一種葉片氣孔表型測量新技術，並對不同玉米材料乾旱脅迫下的氣孔性狀差異及其潛在應用價值進行了深入研究，為解決作物葉片氣孔表型高通量檢測和遺傳機制解析提供技術支撐。
葉片氣孔由特化的表皮細胞形成，是植物內部和外部環境之間氣體交換的主要通道。並且氣孔在作物生長過程中對碳和水迴圈的調節起著重要作用，並影響植株的蒸騰強度和光合作用。此外，葉片氣孔運動是一個複雜的調控過程，受到植物內外部多重因素的影響，目前大部分的葉片氣孔研究手段為有損檢測，尚沒有一套成熟的活體葉片氣孔研究體系。因此，在維持葉片完整性的前提下進行氣孔表型檢測，闡釋非生物逆境脅迫等不同環境下作物大群體葉片氣孔性狀差異，具有重要意義。
本研究利用兩種不同解析度的行動式顯微成像儀（TipScope和ProScope HR2）獲取玉米活體葉片氣孔顯微影象，影象解析度分別為（TipScope，4608×3456 pixels，~6 μm/pixel）和 （ProScope HR2，640×480 pixel，~1.5 μm/pixel）。基於TipScope提取低解析度的氣孔影象，研發FPN深度學習模型提取和分析氣孔數量和氣孔密度；基於ProScope HR2提取的高解析度氣孔影象，研發RCNN模型區分開啟氣孔和閉合氣孔，並計算開閉氣孔數量；對於開啟氣孔，提出一種改進的基於Chan-Vese（CV）模型的分割方法分割氣孔，進而提取氣孔長、氣孔寬、偏心率、氣孔開度、氣孔面積、氣孔周長總計6個氣孔性狀。實驗結果表明，和真實值比較，本技術氣孔表型檢測精度R2在0.85-0.99，平均相對誤差在0.1%-6.34%之間，證明本技術檢測的準確性。
檢測效率方面，本技術無需對樣本進行預處理。處理500張TipScope影象耗時約42秒；ProScope HR2獲取一幅影象的時間約為5~10s，處理500張ProScope影象耗時約40分鐘。總體來說，提取每個葉片所有氣孔特徵的總時間約為10~15s。
圖1 葉片氣孔表型提取和分析流程。A~F：基於TipScope採集影象計算氣孔數和氣孔密度；G~R：基於ProScope HR2採集影象計算氣孔長、氣孔寬、偏心率、氣孔開度、氣孔面積、氣孔周長總計6個氣孔性狀。
為了驗證該方法提取的氣孔性狀的有效性，進一步探索了B73玉米野生型和 Zmfab1a突變體在在正常澆水和乾旱脅迫條件下的氣孔表型差異。研究表明，在乾旱覆水後，Zmfab1a的氣孔開啟數量和氣孔平均面積均高於B73，說明突變體Zmfab1a葉片氣孔乾旱響應和恢復能力高於B73，具有更好的抗旱性。
圖2 野生型B73和突變體Zmfab1a在充足水分（WW）和乾旱脅迫（DS）條件下的氣孔動態響應。A.玉米野生型B73在土壤含水量分別為15%、10%、25%和35%的D32、D35、D36和D37上的氣孔影象。B.在土壤含水量分別為15%、10%、25%和35%的D32、D35、D36和D37上，突變體Zmfab1a的氣孔影象。C.在充足水分和乾旱脅迫條件下，B73和Zmfab1a的4個氣孔特徵（開放氣孔數（OSN）與總氣孔數（TSN）之比、總氣孔面積、氣孔開放度、單氣孔面積）的4天平均值。統計顯著性檢驗：*P<0.05***P<0.01。D.B73和Zmfab1a4個氣孔性狀在4天內的DS/WW變化曲線
為了進一步評估基於改進CV模型的氣孔分割方法的可行性，本研究還測試小麥、水稻、油菜、萵苣、菸草、馬鈴薯、蠶豆、棉花和大豆其他9種植物，實驗結果表明本技術是可以成功推廣到其他作物葉片氣孔表型檢測。
圖3 不同作物的葉片氣孔分割結果：A.小麥；B.大米；C.油菜籽；D.萵苣；E.菸草；F.馬鈴薯；G.蠶豆；H.棉花；I.大豆。
此外，為了增加該方法的實用性和推廣性，本研究還開發了葉片氣孔表型處理入口網站，供全球使用者免費使用，有助於未來作物大群體葉片氣孔動態表型分析和遺傳機制解析。
圖4 葉片氣孔表型提取和分析入口網站（http://x40833180q.zicp.vip/）
綜上所述，本研究提出了一種行動式、低成本（~1000美元）、高通量（~15秒/葉片）的葉片氣孔表型動態提取和分析方法，並建立入口網站供全球使用者開放使用，促進未來大群體作物葉片氣孔表型動態研究和遺傳機制解析。
作者簡介和專案資助：
華中農業大學工學院梁秀英老師和許錫晨碩士生為論文的共同第一作者，楊萬能教授為通訊作者。本研究得到了國家重點研究發展計劃、國家自然科學基金、湖北省科技重大專項和中央高校基礎研究基金的資助。
原文連結：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13741
植物科學最前沿，專注於植物科學前沿進展、資訊、招聘資訊的釋出及方法軟體共享等。投稿及招聘請後臺回覆“投稿”，均為無償；商務合作請聯絡微信ID：zwkxqy；
