天能VE-586丨轉膜實驗原理與操作步驟「嗅嗅網」

• 轉膜是把DNA從瓊脂糖凝膠中轉移到固相支援物(一般是尼龍膜)上固定，是進行各種後續研究(如 RFLP 分析，陽性克隆的篩選驗證等所有涉及分子雜交的研究)的前提。

實驗目的：

掌握 Southern blotting 的原理及操作步驟

實驗原理：

1. 轉膜的方式：

向上的毛細管轉移

向下的毛細管轉移

同時向兩張膜轉移

電轉移

真空轉移

2. 固相支援物的種類及選擇：

硝酸纖維素膜：非共價結合，易脆，易丟失DNA ， < 500 bp 的DNA 無效，轉膜前的工作(從提高轉膜效率，利於轉膜後使用等)。

尼龍膜(帶正電荷的)高強度，不易破損，具有較大的DNA 結合容量，它能夠吸附變性DNA ，核酸以共價結合方式不可逆的結合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有吸附DNA 的功能，無論用哪邊均可以經久耐用，可反覆利用 10 次以上( 10-20 次)，經毛細管(毛細吸附)作用，把DNA 從凝膠上轉到膜上。DNA 轉到膜上是複製膠上的帶型，在 80-100 ℃真空乾燥 2-4 hrs ，即可固定DNA 。

3. 轉移緩衝液( transfer buffer )的選擇：

帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強度( SSC )，但不能充分發揮膜潛能; 0.4N NaOH ，共價結合DNA 是最大優點。

硝酸纖維膜：高鹽離子強度促進DNA 與膜結合( 20 × SSC )，低鹽離子強度導致小片段DNA 在轉移過程中丟失， pH>9 ，DNA 不能與膜結合。

4. 轉膜時間( duration of transfer )約 12 hrs。

取決於毛細管系統，DNA 大小，膠厚度 (<5 mm) 及濃度 (<1%) 。

DNA 分子量大小決定時間長短，部分去嘌呤減小DNA ，鹼轉移 2hrs 大部分結合到膜。

DNA 轉移的效率較難判斷，只有在轉膜結束後，透過 EB 染膠，及分子雜交才可以鑑別效率高低，但已無補救措施，因此，每一步應嚴格操作。

實驗材料及試劑：酶消化好的DNA 樣品，尼龍膜， 0.2NHCl ， 0.4N NaOH 等。

實驗步驟：

1. 0.8% 瓊脂糖電泳。

制膠：注意瓊脂糖的質量，膠的濃度，厚度(<5mm)及均一性。一般大電泳槽配製 250ml 0.8% 瓊脂糖凝膠，採用 42 孔梳子(經濟，高效)。

制樣，點樣：DNA 樣品中指示劑量稍多。

電泳：一般 1-1.5V/cm 的電壓，使DNA 遷移到適當距離，一般指示劑約移動 10-11cm ( 大電泳槽：40V × 12-15hrs ，小電泳槽 30V × 4-5 hrs)。

2. 轉膜前的準備：

依膠大小每塊凝膠準備兩張比膠稍大的濾紙( 11 × 12.5 cm )，兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜( 10 × 10.5cm )，兩個玻璃盤、兩塊有機玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。

3. 一玻璃盤中加入足量的 0.4N NaOH ，放上洗淨的玻璃板，搭製鹽橋。

4. 凝膠的預處理：

a.從電泳槽中移出凝膠置於塑膠板上，用切膠板把膠切成適當大小，切去右上角(最後一個樣品的最前端)作為電泳方向記號。

b.把凝膠翻面，放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盤中，輕輕搖動 10min ，使指示劑變黃色為止(脫嘌呤)。

c.倒去 HCl 溶液，加蒸餾水漂洗凝膠。

d.倒去蒸餾水，加 0.4N NaOH 中和。

e.同時在鹽橋濾紙上灑些 0.4 NaOH ，立即將膠放在鹽橋上(忌氣泡)。

5. 膠的四周用塑膠片與膠緊緊相連，防止短路(吸水紙與鹽橋相接)。

6. 在膠面上倒足夠量 0.4N NaOH ，小心放置膜(預溼 0.4N NaOH )使膜覆蓋整塊膠(要求一次成功，不能移動)。

7. 膜上放 2 張濾紙，濾紙大小為 15 × 12 cm。

8. 放不少於 5 cm 厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約 500g 的重物，轉膜 12 hrs 左右。

9. 轉膜完畢，用 2 × SSC 漂洗膜兩次，各 5min 。用 EB 染膠以檢測轉移效果。

10. 用兩張濾紙包住膜，置於 80-100 ℃的真空乾燥箱中，乾燥 2-4 hrs 。