元
正月十五
宵
今天推送的文章是發表在
ACS Sustainable Chemistry&Engineering
上的“
Enhancing the Thermostability of Engineered Laccases in Aqueous
Betaine-Based Natural Deep Eutectic Solvents
”，通訊作者是那不勒斯大學農業科學系的Cinzia Pezzella。
漆酶是一種廣泛存在的多銅氧化酶，它催化多種酚類和非酚類底物的氧化，並伴隨氧還原成水，這是唯一的反應副產物。氧化的自由基性質導致活性自由基物種作為主要氧化產物，可透過降解和合成過程進化。漆酶在工業過程中應用的挑戰之一是它們能夠保持較長時間的活性或在惡劣的操作條件下生存，因此需要重新設計酶以微調其性質以適應最終應用，從而提高生產效率和酶效能。最近，柔性表面環已被確定為透過應用針對其硬度的修飾來提高酶熱穩定性的潛在目標。提高酶熱穩定性的另一種補充方法包括透過培養、挖掘或宏基因組方法探索微生物多樣性來尋找極端酶。另一方面，酶在固體載體上的固定化已成為實現工業過程中酶的後合成開發、促進酶的重複使用和回收的關鍵技術，同時提高了酶的熱穩定性。
深共熔溶劑(DESs)是氫鍵受體(HBA)(如銨鹽)和氫鍵供體(HBD)(如多元醇和糖)的混合物，與其單個組分相比，熔化溫度顯著降低。DESs的一個子集，稱為NADESs，完全使用天然原料(如糖和氨基酸)製備。DESs作為無毒溶劑因其具有低易燃性、低揮發性、易製備、高溶解性和與酶的相容性等吸引人的特性而得到廣泛應用。更有趣的是，DESs作為共溶劑還可以防止通常在有機溶劑中觀察到的酶失活。
深入瞭解DES組成對酶穩定性和活性的影響，將有助於為特定的生物催化過程量身定做這些綠色溶劑。為了更深入地瞭解這種結構-功能之間的函式關係，本文嘗試了一種基於對接模擬的計算機輔助方法。以Pleurotus Ostreatus的POXA1b漆酶為靶酶。它是一種高氧化還原漆酶，因其適合工業生產的特性而被廣泛應用於不同的領域，如在很寬的pH值(3−9)和溫度(25−65℃)範圍內的穩定性和活性，以及在異源宿主中的高產量水平。更重要的是，作者已經開發了一系列具有改良表型的進化突變體，其中5個在本工作中被測試以研究NADES效應。
HBD對漆酶活性的影響。在T.versicolor漆酶最新研究結果的基礎上，選擇了5 種基於甜菜鹼的 NADES NADES 培養基，在25wt%的水稀釋條件下對POXA1b漆酶及其5個突變體的熱穩定作用進行了測試(表1)，以充分挖掘這一系列突變體在廣泛領域的應用潛力。NADES 基於甜菜鹼作為 HBA，山梨糖醇、木糖醇、甘油、乙二醇或赤蘚糖醇作為 HBD，比例為 2HBA:1HBD。將POXA1b 及其變異體在25℃培養基中培養10min，並與對照液(pH=7的50mM磷酸鹽緩衝液)的相對活性進行比較。所有酶的活性幾乎與參考溶液中的相同，最大增強 20%。這些結果證實了甜菜鹼能夠保護蛋白質免受失活和聚集，並提高基於甜菜鹼的 NADES 中的漆酶活性和穩定性。
表1
HBD對漆酶在70℃下熱穩定性的影響。當在70℃的NADES中孵育時，所有受試漆酶的熱穩定性都有顯著提高(圖1)。雖然不同的HBD對酶的殘留活性有不同的影響，但所有使用的NADES都是有益的。在大多數情況下，漆酶在25 wt% 2Bet:1Sor NADES 溶液中表現出更高的熱穩定性。在25 wt% 2Bet:1Sor NADES溶液中，在70℃下孵育 60 分鐘後，NADES 的存在使 POXA1b 的殘留活性增加了四倍（65% vs 16%）。對於 EV1 和 EV5，由於在相同的 NADES 溶液中孵育而觀察到類似的有益效果，而 25 wt% 2Bet:1Xyl NADES 溶液是 EV3 和 EV4 最有利的 NADES 培養基。
圖1
HBD和HBA在水相中的締合作用。在研究NADES組分與漆酶的相互作用之前，分析了水中HBD和HBA的相互作用，以瞭解液相中是否存在單獨組分或簇狀NADES。圖2顯示了山梨醇和甜菜鹼分子在水和真空中的平均作用力(PMF)隨質心之間分離距離的變化。在真空中，PMF曲線顯示，當間隔為4.4Å時，自由吉布斯能量的最小值約為−4.7kcal mol−1。這意味著這兩個分子之間的淨相互作用是有利的，導致在真空中與有利的範德華相互作用和靜電相互作用相結合。有趣的是，在水中計算的相同的PMF曲線沒有顯示出任何自由能最小值，這表明這兩個分子之間的締合在水中不再受歡迎。從熱力學的角度分析，結果表明，由於水化過程的不利貢獻，在水中可能形成的複合物(山梨醇−甜菜鹼)被阻止了。事實上，複合物的水合作用不如分別水合山梨醇和甜菜鹼。本研究中考慮的其他多元醇具有類似的結構，並會與甜菜鹼和水產生類似的相互作用。因此，HBA和HBD在水中以孤立的分子形式存在，而對於NADES與漆酶的相互作用的研究，將只評估單個NADES組分與酶之間的相互作用。
圖2
漆酶−HBD相互作用的計算分析。為了瞭解NADES組分在漆酶熱降解穩定性中的作用，進行了分子對接計算。在POXA1b蛋白模型中引入了每個POXA1b變異體的有區別的替換，並透過YASARA軟體最小化了各自的能量。計算了每對漆酶變體和每個HBD的最佳漆酶−HBD複合物構象的結合能分佈(kcal mol -1)，並與70℃下殘餘活性測量的結果進行了比較(圖3)。所有酶的剩餘活性與結合能呈正相關(相關係數在0.660-0.965之間)，結合能越正，剩餘活性越高。特別是，山梨醇、木糖醇和赤蘚糖醇對結合能的貢獻程度相似，山梨醇的結合能略高。反之，乙二醇在結合能方面表現出較差的穩定效果。這一行為在所有被測試的酶中都是相同的。還計算了每個漆酶−甜菜鹼複合物的結合能，但不同酶之間的結合能沒有顯著差異，估計值為3.32±0.12kcal mol−1。漆酶蛋白模型上NADES組分的定位如圖4所示。在野生型POXA1b中，甜菜鹼、山梨醇、木糖醇和赤蘚糖醇在L1環的同一區域相互作用，連線結構域2和3，而乙二醇位於活性部位，這可能解釋了該分子穩定作用較差的原因。相反，與甘油的相互作用發生在蛋白質表面的不同區域。在EV1中，會出現一幅不同的互動圖景。甜菜鹼似乎與活性位點相互作用，特別是與該變體的突變殘基H162相互作用。木糖醇、甘油和赤蘚糖醇與L1環暴露區域上的相同殘基相互作用，而乙二醇被預測與L1環的內部相互作用，從而解釋了其對EV1幾乎沒有穩定作用。有趣的是，與山梨醇相互作用所涉及的殘基，導致了這種HBD觀察到的最高結合能，可以確定穩定相互作用的潛在目標。EV2、EV3和EV4展示了類似的互動場景。事實上，甜菜鹼定位於蛋白質表面，而與山梨醇、木糖醇、甘油和赤蘚糖醇的相互作用發生在L1環上，類似於EV1和POXA1b。
圖3
圖4
從NADES效應中獲益最多的漆酶變體EV5也表現出一種特殊的相互作用模式。特別是，甜菜鹼似乎定位在C-末端區域，非常接近P494T突變，以前被證明是導致該變體較低的蛋白質靈活性，從而導致其內在熱穩定性的原因。有趣的是，引起最佳穩定效果的木糖醇和山梨醇在L1環中相互作用，儘管與該環中觀察到的其他相互作用相比，木糖醇和山梨醇在不同和特殊的區域相互作用。這可能表明，雖然L1環代表了NADES相互作用的共同目標，但它們的穩定作用嚴格依賴於每個變體的構象變化。可以預見，NADES對EV5變異體誘導的最高穩定性是由每個HBD建立的協同作用以及甜菜鹼在不同的相互作用位點上的定位所致。此外，對於EV5變體，很明顯，穩定效果隨著多元醇HBD的羥基數量的增加而增加，就像在ChDHP和甜菜鹼基DES中觀察到的T.versicolor漆酶一樣。
25 wt% 2Ber:1Sor NADES 組分對漆酶70℃熱穩定性的影響。為了評估漆酶對高溫穩定性的增強是由於NADES的單個成分還是由於 HBD 和 HBA 的聯合作用，分別製備了與 25 wt% 2Bet：1Sor相同濃度的甜菜鹼和山梨糖醇。漆酶在這些水溶液中在 70℃下孵育，並評估了它們的熱穩定性（圖5）。在15 wt% 甜菜鹼中孵育增加了漆酶的熱穩定性，而在10 wt%山梨糖醇中孵育幾乎沒有或沒有改善。相反，當酶在25 wt% 2Bet:1Sor NADES 溶液中孵育時，漆酶的熱穩定性獲得最高的增益。特別是，EV5 變體在70℃下在NADES溶液中孵育60分鐘時保留了80%的活性，而在兩種單一組分存在下保留了40%的活性，從而證實了HBD和HBA的組合效應NADES對提高熱穩定性的影響。表2 報告了7070℃下有或沒有 2Bet:1Sor NADES 預孵育的漆酶的半衰期。與參考溶液相比，它們的半衰期至少增加兩倍，如EV4和EV5的情況。此外，EV1和EV3的半衰期延長了三倍，而POXA1b和EV2的半衰期延長了近四倍。特別是，在 NADES 溶液中孵育時，EV5和EV2在70℃下表現出最長的半衰期。
圖5
值得注意的是，NADES的熱穩定作用對於每種酶變體都是非常特異的。雖然從相似的t1/2開始，但對於所有的酶來說，實現的增量是不同的，這指出了蛋白質和NADES組分之間所建立的相互作用的特異性的重要性。為了進一步瞭解觀察到的實驗資料，用FoldX方法計算了每個漆酶變異體相對於野生型POXA1b的氨基酸取代引起的吉布斯自由能值(ΔΔG，kcal mol−1)的變化。氨基酸取代對EV5變異體的有益影響(ΔΔG=−8.35kcal mol−1)，而對其他變異體幾乎可以忽略不計。因此，NADES的作用似乎在進一步促進已經耐熱的酶(如EV5的情況)和補償更不耐熱的酶(如EV2的情況)方面都是有效的。
25 wt % 2Ber:1Sor NADES 對漆酶90℃熱穩定性的影響。評估了25 wt% 2Bet:1Sor NADES對漆酶熱穩定性的積極影響，將孵育溫度提高到90℃（圖6）。總的來說，即使在90℃下在NADES中的孵化促進了所有測試漆酶的熱穩定性提高。特別是，EV5 顯示出最高的殘留活性，在25 wt% 2Bet:1Sor 中孵育3分鐘後增加了近45%。
圖6
整理：李嵐雪
文章連結：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.1c07104?ref=PDF
