乾貨 | 重組克隆總連不上，我emo了

為了解決傳統克隆背景高、酶切位點限制等問題，同源重組克隆強勢出圈，用含有同源臂的引物連線載體和插入片段，本應完美解決傳統克隆的問題，順利進行克隆實驗，但實際操作過程中還是經常會出現連不上的情況，到底哪裡出了問題呢，讓我們先從引物這裡找找答案吧。

酶切位點：可以保留，可以不保留，根據後續實驗需求而定；

特異性引物：進行插入片段的PCR擴增，使得插入片段帶上同源臂；

同源臂：利用重組引物的特異性引物片段進行插入片段的擴增，此時插入片段連線了同源臂，後續在重組酶的作用下，將插入片段連到載體上。

其中同源臂是非常重要的部分，它決定著是否能夠將插入片段連到載體上。

彆著急，設計是這麼設計了，但有沒有按要求設計呢？

長度：15-20 bp

位置：載體序列末端

GC含量：40%-60%

✦ 同源臂太短（＜13 bp）沒有連線活性，連線不穩定，會斷開。

✦ 同源臂太長（＞25 bp）重組酶切不到那麼多，連不上。

✦ 同源臂不在載體末端，重組酶切不到可以連線的序列位置，連不了。

✦ 當同源臂設計符合要求時，完美連線。

至於GC含量，Vazyme小課堂為你解答。