編者按：
自然界中，包括人類腸道菌群在內的大多數微生物，都以“混居”形式生存。即使採用實驗室標準化培養技術進行細菌鑑定，也存在失敗的可能，據瞭解，大約有 80% 的細菌無法透過標準化方法進行培養。因此，研究微生物多樣性的最有效方法是採用非培養技術。
今天，我們共同關注腸道菌群表徵技術，探討取樣、測序等方面不同技術的要點和優劣勢。希望本文能夠為相關的產業人士和諸位讀者帶來一些啟發和幫助。
腸菌如何取樣才正確？
一直以來，糞便都是研究腸道菌群的經典樣本，然而，我們也應瞭解，胃腸道中不同區域的菌群是不相同的。例如，在研究低位腸常駐菌群時，糞便樣本並非最可靠樣本，儘管它是臨床研究中最易獲取的樣本。
如果樣品在採集後的 72 小時內無法置於- 80℃以下的環境中冷凍，也可能會出現系統偏差（最好是立即冷凍）。不過，如果採用 95% 乙醇和 RNAlater 等儲存劑的話，那麼樣品可以在室溫狀態下穩定存放 7 天，在此期間微生物組成分不會發生明顯改變。
此外，糞便不同區域的微生物也存在差異（例如：內部以厭氧菌居多，外部則以需氧菌居多），因此建議在提取 DNA 之前，先對樣本進行均質化處理。
由於糞便樣本存在個體差異，因此，為了能更好地表徵腸道菌群的群體性特徵，最佳方法是納入更多的研究物件，並採用前瞻性的方式進行實驗設計，以形成對照研究。
由於胃和小腸較難觸及，菌群取樣難度較大，而且高位腸段的菌群與低位腸段和糞便樣本的菌群相比，存在較大差異，因此當前關於胃和小腸的腸道菌群研究較為缺乏，研究代表性不足。
通常，要實現對胃和小腸菌群的取樣，侵入性取樣方法是必不可少的，如食管胃鏡檢查、結腸鏡、管腔刷檢，甚至是採取腸切除手術。此外，也可以考慮採用其他方法，如直接以進行了迴腸造口術的患者作為研究物件，開展小腸菌群分析，然而此類受試患者有限，樣品也很容易受到面板菌群等汙染。
隨著科技的進步，目前已經研究出了一些新的非侵入方法，比如擁有 pH 和溫度感測器以及獨立電池的膠囊內鏡。這些膠囊內鏡可以定點採集菌群樣本，並且隨著技術的發展，成本也在逐步降低。然而，依舊存在一些這些儀器所無法解決的問題，如汙染（來自指定採集點之外的區域所造成的汙染）、樣品儲存等問題。
取樣是菌群研究的關鍵步驟，因此在取樣時除了要謹慎擇取取樣方法，還應制定嚴格的納入和排除標準，以避免取樣結果出現偏差，例如，感染、近期使用的抗生素或其他藥物、飲食結構變化、併發症等因素都可能會引起菌群失調。
從擴增子測序到鳥槍法
擴增子測序法雖然比較傳統，但仍是當前微生物組領域最常用的技術，如針對細菌的 16S rRNA 測序法和針對真菌的 ITS 測序法。此類方法存在一定侷限性，主要有聚合酶鏈式反應（PCR）會引入偏差，以及基因測序區域有限、分類不夠精確等問題。
大多數用於表徵細菌的分子工具，其原理都是基於細菌基因組之間所存在的進化關係。由於 16S rRNA 基因序列高度保守，並且易於識別進化關係，因此基於 16S rRNA 基因的比對結果，對細菌進行分類是當前最為流行的技術。透過這種方法，細菌可以被歸類到某個特定的屬，甚至有時候可以透過將獲得的序列與GeneBank 和 rDNA 資料庫中已經表徵的物種序列進行對比，從而把細菌歸類到某個特定的種。
然而還是存在很多分類困難的情況，比如當遇到新的細菌時，或者有時由於某些細菌基因序列的同質性較高，難以對細菌進行分類。
採用擴增子測序法可以確定腸道菌群的生態學特徵，如特定細菌或真菌的多樣性和豐度。這表明，該方法可以用於表徵存在的主要微生物，並對個體或群體間進行比較。最常見的生態學引數是 α 多樣性、β 多樣性、相對丰度。
隨著技術的發展，現在越來越多的菌群研究開始採用鳥槍法，對微生物的全基因組進行測序。該方法可避免因PCR擴增導致的潛在偏差，因為這一方法主要透過對樣本中所有 DNA（或 RNA）進行測序，無需事先進行基因標記物的擴增。由於這種方法可以實現對真菌和細菌進行同時測序，而非單獨測序，也使得同一樣本中的微生物譜圖得以拓寬。
除此之外，鳥槍法宏基因組學還可以對菌群中的“暗物質”（宿主病毒、噬菌體和從未表徵過的 DNA 片段）進行分析，這也為腸道菌群的生態學特徵提供了更為準確的分析。
而隨著長讀長測序技術的普及，較長片段的拼接比對提供了更精確的分類結果。因此，操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）或擴增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASV）的使用率將迅速降低。
此外，鳥槍法宏基因組學還可以幫助我們找出細菌和真菌的代謝與功能基因，以對生態學特徵表徵進一步補充。
出於對菌群中罕見微生物的識別必要性，鳥槍法所面臨的問題主要是測序深度。就此而言，首先要注意的點是，與擴增子測序法相比，鳥槍法在較低的測序深度所能提供的關於腸道菌群中罕見微生物的資訊更少。而且，鳥槍法還存在一個問題，那就是由於取樣方法受限，有些樣本所得到的序列大部分來源於人體，而非菌群，這一點在活檢標本及管腔刷檢標本中尤為明顯。
儘管與環境樣本相比，腸道菌群是目前研究最多的部位，但相關資料庫仍然不完整，資訊還是有所缺失。因此，雖然很多資訊可以透過測序等方式得到，但卻無法得到有效利用。
功能宏基因組學
除了新測序技術的獲取，生物資訊學工具也可以幫助我們對腸道菌群功能建立起更全面的認知。Picrust2 等工具可以實現基於擴增子測序得到的資料，推斷出微生物群落中的代謝與致病基因。儘管這類工具無法直接得到功能特徵資訊，但也有助於我們理解可能發生在菌群失調過程中的代謝變化。
鳥槍法可以直接得到微生物群落的功能特徵資訊，如代謝與毒力基因。如果把微生物群落視作一個整體，那麼瞭解微生物群落的功能特徵則比組成更重要。此外，為了對測序結果作進一步補充，通常可以透過生物資訊學分析，表徵特定功能，如抗生素抗性基因或移動遺傳元件。
耐藥動力學是“ one health 假說”倡導的重要特徵，也是抗生素抗性基因在人類、動物和環境之間轉移的證據。對於移動遺傳元件，為了確定其質粒/轉座子/整合子的結構，需要結合長讀長測序技術和短讀長測序技術。噬菌體雖然是細菌水平基因轉移的重要參與者，然而有關噬菌體在抗生素抗性基因轉移中所發揮的作用，是否如同在毒力基因傳播中表現得那樣，至今尚未揭曉。
多組學聯合分析
多組學或整合組學（基因組學-轉錄組學-蛋白組學-代謝組學）正成為生物資訊學領域重要且便於使用的工具，可以全面表徵與疾病有關的菌群功能，以及隨時間推移個體內的變化情況，這些變化有別於因疾病、抗生素、飲食變化等引起的任何失調。
由於每個組學都有自己的實驗流程，而且有時需要從同一個體中提取多個樣本，因此每個組學都是獨立進行的，不過所有結果都會進行聯合分析，以重構菌群生理網路。此外，運用多組學方法不僅能瞭解微生物群落，還可以瞭解其與宿主的關係，這也是件很有意思的事情。
這種方法所面臨的挑戰主要是如何將由大量實驗產生的不同型別的資料整合到一起。邊際相關分析、迴歸分析、高斯或貝葉斯模型等統計方法主要用於解決那些由多個統計學獨立觀測所推斷得出的基因、轉錄、蛋白質和代謝物之間關係。正如所有新領域在探索過程中都會歷經的那樣，這些統計方法在質疑聲中不斷改進前行，直到摸索建立出一套適合研究腸道菌群生理學的方法。
原文連結：
WGO handbook on gut microbiome：a global perspective
作者｜Paúl Cárdenas, MD, PhD
編譯｜77
審校｜617
編輯｜三木
