兄弟們~我又又又來啦[送心] 上期的文獻分享，我們講了關於RNA甲基化，
梳理了一篇影響因子6分左右的SCI。
今天，我們一起來看看影響因子12左右的文章怎麼研究RNA甲基化的吧~
這次分享的文獻題目是：Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A，影響因子為11.492分，發表在2020年12月的RESEARCH ARTICLE 雜誌上。
想了解高分文章是怎麼研究RNA甲基化的夥伴們，現在就跟著我，踏著之前文獻解讀裡整理的“標準步驟”往下看吧~
一、缺氧損害血管生成能力，鉅細胞胚胎幹細胞中ALKBH5表達上調
為了闡明m6A在缺血後血管生成中的作用，作者分離了心臟微血管內皮細胞（CMECs）。CCK-8實驗發現CMECs的存活能力在缺氧3小時後開始增加，在12小時時達到峰值，在24小時後又顯著下降（Figure 1A）。EdU實驗分析顯示，缺氧24小時後EdU陽性細胞的比例顯著降低（Figure1B-C）。此外，CMECs細胞的遷移、侵襲及血管形成能力在缺氧條件下亦顯著降低（Figure1B, D-F）。綜上，24小時缺氧抑制心臟微血管內皮細胞的增殖、遷移和血管生成能力。
m6A點斑實驗表明缺氧使得CMECs中m6A丰度顯著降低（Figure 1G）。而RT-qPCR實驗發現甲基轉移酶WTAP和去甲基化酶ALKBH5在缺氧損傷後其mRNA水平顯著上調（Figure 1H），但在缺氧CMECs中，只有m6A去甲基化酶ALKBH5的蛋白水平表達顯著上調（Figure1I -J）。
二、ALKBH5過表達加劇了缺氧誘導的鉅細胞的細胞功能障礙
接下來，作者透過一系列的實驗檢測缺氧誘導的ALKBH5是否影響CMECs血管生成。首先在常氧和低氧的CMECs模型中建立ALKBH5過表達模型（Figure 2A）。m6A斑點實驗顯示，在缺氧和常氧條件下，ALKBH5過表達後m6A丰度降低（Figure 2B）。此外，ALKBH5的過表達降低了缺氧條件下的CMECs增殖（Figure 2C-E）、遷移和侵襲（Figure 2F-I）及血管生成能力（Figure2J-K），但是對常氧條件下的細胞無影響。綜上，ALKBH5的上調嚴重加劇了缺氧條件下的CMECs功能障礙，從而導致血管生成受損。
三、ALKBH5敲低降低了CMECs缺氧誘導的功能障礙
首先，在常氧和缺氧條件下，建立ALKBH5敲低模型（Figure 3A）。m6A斑點實驗發現，常氧和缺氧條件下，ALKBH5的敲低顯著均提升了整體m6A水平（Figures 3B）。但是，僅在缺氧條件下增強了細胞的增殖（Figures 3C-E）、遷移和侵襲（Figures 3F-I）以及血管形成能力（Figures 3J-K）。在常氧條件下，ALKBH5的敲低不影響上述細胞功能。綜上，ALKBH5的敲低在防止缺氧誘導的內皮血管生成損傷方面起著關鍵作用。
四、MeRIP-seq與RNA-seq聯合發現了ALKBH5潛在的靶基因
以上結果已經表明，ALKBH5與缺氧誘導的內皮血管生成密切相關，對ALKBH5敲降後，透過MeRIP-seq與RNA-seq方法進行檢測，MeRIPseq共發現12783個共有峰，對照組477個獨特峰，ALKBH5敲降CMECs中2358個獨特峰。此外，發現了771個低甲基化峰和1072個高甲基化峰（Figure 4A），MeRIP-seq進一步揭示了峰的分佈特徵（Figure 4B）和差異甲基化mRNA峰值的百分比（Figure 4C）。基於這些資料，對兩個CMECs組進行了具有代表性的motif分析(Figure 4D)。富集基因差異表達分析顯示，1352個基因表達下調，2914個基因表達上調(Figure 4E)，C型利鈉肽和FBXW5分別為低甲基化和高甲基化的代表(Figure 4F)。對這些基因進行了GO分析，發現低甲基化轉錄本的富集主要參與細胞週期和RNA代謝等過程，而高甲基化轉錄本主要富集於血管新生和細胞增殖調控(Figure 4G)。POSTAR、血管生成資料庫、MeRIP-seq 資料和RNA-seq 資料得到，ALKBH5的靶基因能調節血管生成。從中選出的SKP2、WNT5A、FGF18可能是ALKBH5促血管生成的靶基因（Figure 4H），故後續對它們進行進一步研究。
五、ALKBH5調控WNT5A mRNA的穩定性和衰減情況
MeRIP-seq資料顯示，敲除ALKBH5後，SKP2、WNT5A和FGF18的m6A丰度顯著增加（Figure 5A-B），RT-qPCR和Western blot分析得到，沉默ALKBH5，WB和QPCR的實驗表明，WNT5A表達增高，但SKP2和FGF18表達變化不明顯（Figure 5C-D），故後續選擇WNT5A來進行研究。因為mRNA m6A的內部修飾對靶基因存在mRNA的穩定性和衰減存在影響，所以採用放線菌素D來檢測WNT5A mRNA的穩定性和衰減情況，新增放線菌素D之後，WNT5A表達呈時間依賴性降低，敲除 ALKBH5能顯著延遲WNT5A mRNA的降解，從而延長了其半衰期（Figure 5E）。進一步發現，ALKBH5過表達顯著降低了WNT5A的蛋白和mRNA表達水平、縮短了WNT5A mRNA的半衰期並降低了其穩定性（Figure 5F-H）。而且，透過一系列細胞生物學實驗發現，WNT5A激動劑可以顯著逆轉過表達ALKBH5對CMECs增殖、遷移、血管形成的抑制作用（Figure 5I-L）。
以上結果得到，ALKBH5透過去除轉錄後的m6A修飾，促進WNT5A mRNA的衰變，降低其半衰期，從而影響缺氧條件下CMECs的生物學功能。
六、ALKBH5過表達減弱小鼠後肢缺血造成的小鼠缺血損傷後的血流恢復和血管生成作用
作者建立了小鼠後肢缺血模型，然後檢測ALKBH5在模型中一段時間的表達情況。結果所示，ALKBH5隨著時間的推移呈動態變化，在6小時以內，呈增高趨勢，缺血後1-21天時，呈降低趨勢，到28天時，ALKBH5的表達已回覆至缺血前。為了研究ALKBH5在體內對缺血血管生成的影響，在小鼠後肢缺血前4周，透過AAV注射小鼠腓腸肌，使ALKBH5持續過表達（Figure 6A）。資料顯示，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白顯著上調（補充資料加Figure 6B），在過表達ALKBH5的情況下，m6A丰度顯著降低（Figure 6C），透過鐳射多普勒超聲掃描系統後肢缺血後的血流恢復情況發現，與對照組相比，過表達ALKBH5的小鼠後肢缺血後7-21天血流恢復率明顯降低（Figure 6D-E），毛細血管和小動脈中的CD31（血管生成標誌物）和α-SMA在過表達ALKBH5的條件下也降低（Figure 6F-G），因此，以上資料表明，過表達ALKBH5會減弱小鼠後肢缺血模型中的血流恢復和缺血後血管的生成。
七、敲除或敲降小鼠中的ALKBH5基因能有效改善缺血損傷後血管生成和血流恢復
首先採用ALKBH5 KO小鼠來進行實驗，斑點雜交實驗和主動脈環實驗表明，ALKBH5 KO小鼠主動脈環和腓腸肌組織中m6A丰度均顯著增加；ALKBH5 KO小鼠在主動脈環中的血管發芽情況與WT小鼠相比更強（Figure 7A-C）；而且，ALKBH5 KO小鼠後肢缺血後7-21天血流恢復明顯增強，腓腸肌中的CD31和α-SMA的表達也明顯上調（Figure 7D-E）。
以上結果說明，ALKBH5 KO對缺血後血管生成具有保護作用。其次，透過短期下調ALKBH5來探索其影響。在後肢缺血後7天和14天，作者透過腺病毒注射WT小鼠腓腸肌，啟動了ALKBH5的短期和瞬時下調（Figure 7F），腺病毒注射後1、2、3周，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白表達顯著降低（Figure 7G），在抑制ALKBH5的情況下，斑點雜交檢測顯示缺血3周後腓腸肌m6A水平顯著升高（Figure 7H）。在敲除ALKBH5後，發現缺血腓腸肌中CD31和α-SMA表達水平顯著升高（Figure 7I）。鐳射多普勒超聲掃描資料顯示，ALKBH5敲除小鼠血流恢復明顯改善(Figure 7J)。以上所有資料說明，ALKBH5在缺血後血管生成中的起著關鍵作用，敲除或敲降小鼠中的ALKBH5能有效改善缺血損傷後血管生成和血流恢復。
綜上我們這期的文獻就解析完了，我們再來彙總一下研究的層次：
首先透過經典的m6A實驗“dot blot”，發現缺氧能導致CMECs細胞整體m6A水平的減弱，從一堆m6A相關基因中，作者找到了關鍵因子ALKBH5，並發現其異常表達影響內皮細胞的血管生成能力。
然後，作者透過MeRIP-seq找到ALKBH5潛在的靶基因WNT5A，並發現ALKBH5透過去除轉錄後的m6A修飾，降低WNT5A mRNA的穩定性。
最後，在體內模型中檢測ALKBH5的敲低能有效改善缺血損傷後血管生成和血流恢復。
回味一下，這篇11分多的文章也不是那麼複雜，和上一篇文獻相比，僅多了MeRIP-seq這個與m6A相關的研究方法。透過連續兩期的m6A的文獻學習，基本套路應該已熟記於心了吧！如果現在正好要設計相關方向課題的同學們，可以參考一下喲~
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下期不見不散~
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