編譯：微科盟清韻，編輯：微科盟茗溪、江舜堯。
導讀
抗生素和沉積物都會影響水生系統的反硝化作用。然而，目前對抗生素如何在沉積物存在的情況下影響反硝化作用知之甚少。本文研究了抗生素（磺胺甲噁唑、四環素和氧氟沙星）在沉澱物不存在和沉澱物存在的情況下對反硝化作用的影響。透過量化細菌的反硝化功能基因（DNGs）和16S-Seq以及抗生素抗性基因（ARGs）來揭示相關的影響機制。結果表明，抗生素的存在透過降低narG、nirK、nosZ、總DNGs和反硝化細菌的丰度來抑制NO3--N的還原。然而，這種抑制作用被沉積物的存在所緩解，沉積物的存在促進了細菌的生長，降低了抗生素作為細菌和抗生素載體的選擇壓力，從而增加了反硝化細菌和所有DNGs的丰度。偏最小二乘路徑模型表明，抗生素對細菌、ARGs和DNGs有負效應，沉積物對ARGs有負效應，卻對細菌和DNGs有正效應。網路分析進一步揭示了Bacillus、Acinetobacter和Enterobacter與ARGs和DNGs有密切關係。這些研究結果有助於理解抗生素汙染的天然水域中的反硝化作用。
圖文摘要
論文ID
原名：Sediments alleviate the inhibition effects of antibiotics on denitrification: Functional gene, microbial community, and antibiotic resistance gene analysis
譯名：沉積物減輕抗生素對反硝化作用的抑制作用：功能基因、微生物群落和抗生素抗性基因分析
期刊：Science of the Total Environment
IF：7.963
發表時間：2021.9.7
通訊作者：孫衛玲
通訊作者單位：北京大學
DOI號：10.1016/j.scitotenv.2021.150092
實驗材料與方法
前言
河流中硝酸鹽（NO3--N）汙染成為世界範圍內日益嚴重的公共衛生問題。反硝化是天然水體去除氮的關鍵。隨著抗生素在人類和動物中的廣泛應用，在水環境中經常檢測到ng/L到μg/L水平的抗生素。除了促進抗生素抗性基因（ARGs）的傳播外，水環境中殘留的抗生素還會干擾氮的微生物轉化。以前的研究表明，抗生素可以抑制反硝化細菌的生長，改變反硝化細菌的群落結構和功能基因丰度（如narG、napA、nirK、nirS、norB和nosZ），增加NO2--N的積累。硫黴素和磺胺甲噁唑（SMX）可以促進NO2--N和N2O的積累，同時減緩了反硝化速率。SMX濃度的增加顯著促進了N2O的釋放。
懸浮泥沙普遍存在於天然河流中，在氮迴圈中發揮著重要作用，特別是在反硝化過程中。懸浮沉積物不僅可以釋放有機或無機底物，還可以提供缺氧的環境，促進微生物的生長。因此，沉積物的存在顯著加快了水系統中的反硝化速率，並增加了細菌的丰度。此外，沉積物可以吸附有機汙染物，改變有機汙染物對反硝化的影響。有研究發現環境相關濃度的萬古黴素、氟甲喹和SMX會被天然沉積物吸附，對硝酸鹽還原沒有影響。暴露於土黴素（1μg/L）後，沉積物中硝酸還原酶基因的丰度增加。百菌清很容易被沉積物表面吸附，從而透過抑制微生物活性導致NO3−-N的積累。然而，儘管關於沉積物或抗生素對反硝化作用的影響的研究很多，但沉積物如何影響抗生素對反硝化和反硝化細菌群落的影響仍不清楚。
本研究選擇SMX、TC和氧氟沙星（OFL）3種抗生素作為目標有機汙染物。在無沉積物和有沉積物的條件下，研究了抗生素對NO3--N反硝化的影響。透過絕對定量、16S-seq和qPCR對反硝化微生物群落結構和功能基因進行分析，揭示抗生素和沉積物對反硝化作用的影響機制。此外，基於ARGs的高通量分析，研究了在不同抗生素脅迫下，ARGs的變化及其與NO3--N反硝化的關係。本研究為抗生素對反硝化作用的影響提供了新的視角，並強化了沉積物對抗生素汙染的天然水體中NO3--N去除的重要性。
結果與討論
1 抗生素對有無沉積物反硝化作用的影響
如圖1a-c所示，NO3--N還原過程可分為兩個階段：緩慢適應階段（0-6h）和快速反應階段（6-12h）。相應地，細菌的生物量在適應期內保持不變，然後在快速反應階段迅速增長（圖S1）。這類似於地下水中的反硝化過程。在適應階段，暴露於抗生素的NO3--N在環境（10和100μg/L）和廢水濃度（1和10mg/L）下的去除率分別為12.0~27.6%和0.24~4.8%。在快速去除階段，除暴露在100μg/L氧氟沙星（OFL）外，大多數NO3--N（96.1-100%）在環境濃度（10和100μg/L）下被去除。在100μg/L的OFL暴露組中，由於較低的生物量，僅有42.8%的NO3--N被去除（圖S1c）。在廢水濃度為1mg/L和10mg/L時，抗生素明顯抑制細菌生長和NO3--N還原。
高濃度的抗生素（1mg/L和10mg/L）對NO3--N還原有明顯的抑制作用。此外，抗生素對NO3--N還原的抑制作用遵循OFL>TC（四環素）>SMX（磺胺甲噁唑）的順序。在抗生素濃度為1mg/L時，12h內NO3--N的去除率依次為SMX（56.0%）>TC（31.0%）>OFL（9.13%），這一結果與前人的發現是一致的。抗生素的濃度和型別是影響反硝化細菌敏感性的主要因素，其敏感性順序為恩諾沙星（ENR）>TC>SMX>ETM>克林黴素（CLI）（100ng/L~100mg/L）。以前的研究進一步表明，新增環境濃度（50~300μg/L）的OTC和環丙沙星（CIP）對反硝化作用沒有明顯影響，而對NO3--N的還原作用，在較高濃度（10~100mg/L）下的抑制作用依次為SMX>金黴素（CTC）>阿莫西林（AMX）>CIP。
圖1. 無沉澱物條件下抗生素（10μg/L-10mg/L）對反硝化的影響。
根據0~10g/L不同濃度的沉積物下的NO3--N還原率和NO2--N的最大濃度（Text 4和圖S2），選擇10g/L的沉積物來研究抗生素在沉積物存在下對反硝化的影響。與沒有沉積物存在的反硝化曲線相比，沉積物的存在顯著減輕了SMX、TC和OFL的抑制作用（圖2a-c）。在無沉澱物的情況下，SMX、TC和OFL濃度為1mg/L時，NO3--N的最終去除率分別為56.0%、31.0%和9.13%，而在有沉澱物存在的情況下，相應的去除率分別為99.5%、100%和100%。沉積物對各種抗生素抑制作用的減輕可能歸因於：（1）水相中的微生物傾向於附著在沉積物表面，這導致細菌在沉積物中的定殖和營養物質的富集而快速生長。已經發現沉積物可以作為細菌的載體，並顯著增加細菌的丰度。（2）沉積物對抗生素的吸附降低了其在水相中的濃度。這降低了細菌中有效抗生素的濃度，因為吸附在沉積物上的抗生素的可利用性低於溶解的抗生素。事實上，如圖S3所示，沉積物對抗生素有不同程度的吸附，這減輕了抗生素的毒性並縮短了緩慢適應階段。
此外，與之前的研究結果一致，本研究觀察到了NO2--N的積累，並且峰值的對應於NO3--N的快速去除（圖1d-f）。與沒有抗生素時相比，有抗生素時NO2--N的濃度僅略有增加。在無沉澱物的情況下，100μg/L的SMX和TC增加了NO2--N的積累，分別是對照樣品的1.09倍和1.69倍。與NO3--N還原相比，NO2--N還原對抗生素更為敏感。100μg/L的TC沒有顯著影響NO3--N的還原，但顯著增加了NO2--N的積累（圖1e）。抗生素對NO2--N還原酶的影響比對NO3--N還原酶的影響更強。在沉積物存在的情況下，10和100μg/L的SMX、TC和OFL加快了NO2--N的還原，NO2--N的積累量分別比對照減少了32.14%、16.67%和5.4%（圖2d-f）。此外，在1mg/L的抗生素濃度下觀察到NO2--N的積累但迅速減少。這表明從水相中去除了氮。
圖2. 在沉積物（10g/L）存在的情況下，抗生素（10μg/L~10mg/L）對反硝化的影響（誤差棒表示標準差）。
2 反硝化功能基因的響應
負責反硝化作用的反硝化功能基因（DNGs）的丰度如圖3和表S6所示。研究表明，DNGs的丰度與反硝化速率相關，DNGs的相對丰度可以表徵反硝化過程。膜結合硝酸還原酶基因（narG）存在於Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria中，而周質硝酸還原酶基因（napA）只存在於Proteobacteria中。W組和S組中的narG的相對丰度均高於napA，表明膜結合硝酸還原酶可能在NO3--N還原中起重要作用（圖3a和b）。與對照樣品（W-CK）相比，W組narG的相對丰度下降，而napA的相對丰度無顯著差異。這可能表明narG更容易受到抗生素（100μg/L）的影響。含銅亞硝酸還原酶基因（nirK）和含細胞色素cd1的亞硝酸還原酶基因（nirS）參與了NO2--N還原為NO的過程，且nirK的相對丰度高於nirS（圖3c和d）。此外，W組nirK的相對丰度低於對照（W-CK），但nirS沒有顯著差異，表明nirK也容易被抗生素（100μg/L）抑制。不同於以往的研究，硝酸還原酶基因（narG和napA）的相對丰度顯著高於亞硝酸還原酶基因（nirK和nirS），這解釋了NO2--N的積累。
抗生素的新增顯著降低了W組中的narG、nirK、nosZ和總DNGs的丰度（圖3和圖S4），進一步強調抗生素對反硝化具有抑制作用，特別是對NO3--N、NO2--N和N2O還原。有研究結果表明，當土黴素濃度大於0.25mg/L時，DNGs的丰度顯著降低。有研究還發現，暴露於SMZ、CTC或AMX後，narG基因的表達丰度顯著降低。還有研究表明土壤中殘留的抗生素降低了DNGs的丰度。本研究的結果表明，沉積物的新增顯著增加了所有DNGs的相對丰度，尤其是napA和nirS的相對丰度。這解釋了沉積物促進了NO3--N和NO2--N的還原（圖2）。研究還觀察到沉積物的存在增加了DNGs的丰度。這可以解釋沉澱物的存在減輕了抗生素的抑制作用的事實。
圖3. 不同處理組（W，無沉積物的水溶液；S，新增沉積物；抗生素濃度100μg/L；沉積物濃度10g/L）的反硝化功能基因丰度（誤差棒表示標準差，不同字母表示不同樣本間差異顯著，單因素方差分析：p
3 細菌群落的變異
透過絕對量化16S-seq（AQS）評估了抗生素和沉積物對微生物多樣性的影響。經過質量過濾、剪接和嵌合體去除之後，總共使用了1,535,122個reads用於後續的分析。不同樣品有60-78個OTUs，其中25個OTUs為所有樣品所共有（圖S5a）。Venn圖顯示，在無沉積物和有沉積物存在的情況下，樣品分別有28個和34個OTUs（圖S5b和c）。W組和S組在群落豐富度（觀察到的物種，Chao1，ACE）和多樣性（Shannon，Simpson）方面沒有顯著差異（表S7）。但是，透過Bray-Curtis距離對細菌群落的PCoA分析表明，W組與S組的細菌群落是有差異的（圖S6）。
抗生素的新增使細菌丰度從1.8×105降低到1.4×105-1.7×105copies/ng DNA（圖4a）。有研究發現抗生素也會降低優勢反硝化細菌屬的丰度。相反，沉積物的新增顯著增加了反硝化細菌的丰度。沉積物中的微生境和基質有利於細菌粘附在沉積物表面，導致反硝化細菌數量增加。此外，在S組中，抗生素對細菌的生長沒有明顯的抑制作用。結果表明，沉積物透過促進細菌的生長，緩解了SMX、TC和OFL的抑制作用（圖2a-c）。
屬水平上，Acinetobacter在所有樣品中佔優勢，佔總丰度的64.7-82.0%，其次是Enterobacter（1.66-8.69%）、Bacillus（1.73-7.17%）、Klebsiella（1.95-4.54%）和Lysinibacillus（0.60-2.45%）（圖4b和S7）。具有反硝化效能的Acinetobacter廣泛存在於天然和工程系統中，已從飲用水、地下水、城市活性汙泥、製藥廢水和水產養殖廢水中分離出來。與整個微生物群落相似，新增抗生素降低了W組中Acinetobacter的丰度，表明Acinetobacter也受到抗生素的影響。沉積物的新增增加了Acinetobacter的丰度。以前的研究發現沉積物中Acinetobacte的丰度與碳水化合物代謝有關，而碳水化合物代謝是由底物富集驅動的。
PICRUSt2對群落功能的預測揭示了所有樣本中共有30條2級代謝通路和144條3級代謝通路，分別屬於6個KEGG代謝通路組（1級）（圖4c和圖S8）。KEGG代謝途徑為主要代謝組，佔總相對丰度的81.4-82.1%。這與廢水和垃圾滲濾液中的結果一致。輔助因子和維生素代謝（14.4~15.0%）、氨基酸代謝（13.9~14.3%）和碳水化合物代謝（12.0~12.8%）是2級最主要的代謝途徑。氨基酸代謝的變化與反硝化細菌的耐受性有關。D-谷氨醯胺和D-穀氨酸代謝（3級）在反硝化過程中起著重要的作用，為反硝化過程提供碳和質子（圖S8）和保護細菌免受氧化應激或化學毒性。這可能有助於反硝化細菌對抗生素的適應或抗性。此外，葉酸生物合成也是一株新型好氧反硝化菌Acinetobacter sp. YT03的主要代謝途徑。
圖4. 不同暴露組門（A）和屬（B）水平的微生物群落組成；（C）PICRUSt2基於通用引物對獲得的16S rRNA標記基因預測的微生物群落代謝途徑。
4. ARGs和MGEs的變化
為了探討反硝化細菌對各種抗生素的耐藥性，基於HT-qPCR技術檢測了181個ARGs亞型和10個移動遺傳元件（MGEs）（圖5a-e和圖S9）。檢測到的耐藥基因主要為多藥耐藥、β-內醯胺酶、四環素、磺胺、MLSB和氯黴素基因。向日葵（sunflower）圖顯示，所有樣本共有37個基因（佔總ARGs的20.4%）。S組（57）比W組（48）共享更多的引數。PCoA圖顯示S組與W組在第一軸上分離，可解釋56.2%的方差。結果表明，沉積物的加入可能改變了細菌群落，尤其是攜帶ARGs的細菌群落。基因多樣性可以被用來衡量抗生素抗性性狀，這些性狀受到水平基因轉移或選擇壓力的影響。新增抗生素增加了W組的ARGs多樣性，而S組則相反，儘管新增抗生素增加了ARGs的豐富度（表S8）。據報道，抗生素的新增增加了魚腸道、土壤和電化學反應器中的ARGs多樣性，這可能與抗生素的選擇壓力有關。
ARGs的相對丰度可以揭示攜帶ARG的細菌的百分比。其中，新增抗生素顯著降低了W組和S組的ARGs相對丰度（圖5f）。有研究顯示，反硝化過程中的電子轉移降低了抗生素的選擇壓力，導致ARGs水平下降。此外，W組ARGs相對丰度的下降可能歸因於細菌丰度的下降。另一方面，沉積物的存在也降低了ARGs的相對丰度。這可能歸因於這樣一個事實，即抗生素在沉積物上的吸附緩解了抗生素的選擇壓力，這促進了沒有ARGs的細菌的生長。
圖5. （a-c）向日葵和維恩圖（花瓣中的數字表示ARGs的數量），（d和e）網路分析，以及（f和g）不同抗生素（100μg/L）樣品在無沉澱物和存在沉澱物（10g/L）的情況下ARGs的相對丰度。
5. PLS-PM分析和網路分析
PLS-PM分析（圖6a）表明，抗生素對細菌（−0.088）、MGEs（−0.579）、ARGs（−0.533）和DNG（−0.361）有負面影響，進一步支援了抗生素可以抑制細菌生長，降低DNGs丰度的觀點。這解釋了抗生素對反硝化的抑制作用。沉積物對細菌（0.784）和DNGs（0.705）有顯著的積極影響，進一步證實了沉積物的新增促進了細菌的生長，增加了DNGs的丰度，從而加速了反硝化作用。而沉積物對MGEs（−0.518）和ARGs（−0.838）有負面影響，這可能是因為沉積物的加入透過吸附緩解了抗生素的選擇壓力，促進了不含ARGs的細菌的生長。沉積物（0.705）和細菌（0.105）對DNGs有直接的正效應，而MEGs（−0.276）、抗生素（−0.361）和ARGs（−0.078）對DNGs有直接的負效應。
Spearman相關分析顯示MGEs與ARGs呈密切正相關（r=0.88，p
本研究強調，由於抗生素廣泛存在於水環境中，其對反硝化作用的影響不容忽視。此外，本研究還揭示了沉積物在緩解抗生素對反硝化作用中的關鍵作用，也揭示了抗生素和沉積物對反硝化作用的影響機制。這些研究結果為評估天然水域中抗生素的潛在風險提供了新的見解。
圖6. （a）PLS-PM描述了抗生素、沉澱物、細菌、MGEs、ARGs和DNGs之間的關係，（b）網路分析揭示了ARGs、MGEs（整合子和轉座酶）、DNGs和細菌之間的關係（節點按模組類別著色）。節點的形狀和大小分別表示引數的型別和連線引數的數量。連線表示與Spearman相關係數有很強的相關性（p≥0.7或p≤−0.7）。
結論
本研究研究了3種常用抗生素在無沉積物和有沉積物條件下對反硝化作用的影響，並透過對微生物群落結構、DNGs和ARGs丰度進行分析揭示了其作用機理。結果表明，抗生素在相對較高濃度下對NO3--N的還原有抑制作用，其抑制程度為OFL>TC>SMX，其原因是由於抗生素降低了細菌、narG、nirK、nosZ和總DNGs的丰度。相反，在沉積物的存在下，由於細菌和所有DNGs的丰度增加，抑制作用顯著減輕。ARGs分析表明，抗生素的新增降低了ARGs的相對丰度，這可能是由於反硝化過程中的電子傳遞降低了抗生素的選擇壓力。此外，沉積物的存在還降低了ARGs的相對丰度，因為抗生素在沉積物上的吸附減輕了抗生素的選擇壓力，促進了不含ARGs的細菌的生長。PLS-PM分析進一步證實了上述結果，表明抗生素對細菌、MGEs、ARGs和DNGs有負面影響，而沉積物對細菌和DNGs有正面影響。網路分析進一步證明Bacillus、Acinetobacter和Enterobacter與ARGs和DNGs密切相關。
