撰文 | 鹹姐
胃癌（GC）的高發病率和不良預後使其成為全球第五大最常見癌症和第三大癌症死亡原因。幽門螺旋桿菌感染、飲食問題、飲酒和吸菸等對胃上皮的損傷常常會導致胃癌前病變——解痙多肽表達化生（SPEM）或腸化生（IM），再加上基因多型性和突變的累積，將最終導致疾病發展為更晚期的腺癌【1,2】。儘管TCGA資料庫提供了GC中潛在的基因突變譜，但是對於不同基本階段的時間順序、單個基因突變的貢獻和分子事件仍有許多未知。阻礙目前對導致GC發生和發展的分子事件的剖析的原因之一在於缺乏合適的小鼠模型，雖然現有模型促進了早期GC的研究，但是這些模型很少能發展為轉移性癌症，使得無法用於解釋疾病進展的潛在機制。
2021年12月2日，來自新加坡A*STAR分子與細胞生物學研究所的N. Barker團隊在Nature Cell Biology上線上發表題為 A tumour-resident Lgr5+ stem-cell-like pool drives the establishment and progression of advanced gastric cancers，利用Claudin18-IRES-CreERT2（Cldn18-IRES-CreERT2）等位基因，以選擇性地驅動胃上皮內Wnt、受體酪氨酸激酶和Trp53通路的條件性失調，從而構建了高度重複的轉移性、染色體不穩定型胃癌模型，準確再現了晚期人類胃癌特徵，同時開發了原位腫瘤類器官移植模型，證明了腫瘤駐留Lgr5+幹細胞樣細胞對GC的發生和轉移至關重要。由此為獲得癌症進展的臨床相關機制見解和評估治療靶點提供了寶貴的臨床前模型。
據報道，Cldn18僅在胃腸道內的胃上皮表達。本文研究人員透過實驗證實，Cldn18僅在胃的整個腺上皮中強烈表達，包括分別位於幽門部和胃體部的腺體底部的Lgr5+幹細胞和儲備幹細胞群。研究人員透過在內源性Cldn18編碼區後插入IRES-Cre-ERT2元件而構建了胃特異性Cldn18-IRES-CreERT2轉基因小鼠，該方法保留了內源性Cldn18的表達和功能，從而最大限度地減少了對其作為緊密連線組分的作用的影響。與此同時，研究人員對TCGA資料庫中的GC樣本進行了基因組和轉錄組學分析，以評估人類GC中失調的關鍵通路的患病率，結果發現在GC中，異常調節的WNT和KRAS訊號通路之間存在顯著重疊（77.9%），而當結合TP53突變時，觀察到29.1%同時發生的WNT和KRAS通路活性失調，由此提示這三個通路可能共同驅動了人類GC的發展。
基於以上，研究人員隨後將Cldn18-CreERT2小鼠與Apcfl/fl、KrasG12D和/或Trp53fl/fl小鼠雜交，分別獲得胃上皮選擇性條件性Wnt訊號啟用、Kras訊號啟用或條件性Trp53功能喪失的小鼠。實驗結果顯示，只有單獨條件性靶向Apcfl/fl可導致侵犯幽門且轉移頻率相對較低的管狀胃癌；同時，複合靶向Apcfl/fl和KrasG12D突變（AK）可導致整個胃部腫瘤的高效形成，而伴隨Trp53缺失的KrasG12D啟用（TK）則在胃體部產生更晚期的腺癌（經常擴散至肝臟和胰腺）。由此對每種通路在驅動胃體部和幽門部腫瘤中的作用提出了重要的見解，並強調了由此產生的腫瘤潛伏期的變化。進一步地，為了獲得更真實的轉移性GC條件模型，研究人員將Apc條件等位基因突變（ApcWT/fl）、KrasG12D和Trp53fl/fl突變引入胃上皮，獲得ApcWt/flKrasG12DTrp53fl/fl（Cldn18-ATK）小鼠，該小鼠胃體部浸潤性腫瘤形成的頻率很高，且伴隨高轉移率（圖1）。
圖1
隨後，研究人員分析了Cldn18-ATK小鼠腫瘤與人類正常和腫瘤樣本轉錄組之間的相關性。結果顯示，與正常組織相比，Cldn18-ATK侵襲性腫瘤與人類腫瘤之間的相關性更強，而瘤形成期Cldn18-ATK上皮與人類正常組織轉錄組的關係更為密切。將人類腫瘤樣本中上調的差異表達基因（DEG）與侵襲性和瘤形成期Cldn18-ATK轉錄組之間的DEG進行比較，發現了TCGA和Cldn18-ATK佇列中有157個DEG和20個GO註釋通路的重疊。與此同時，對Cldn18-ATK腫瘤及其倫理上合適的終末期轉移的組織學分析顯示，其特徵類似於人類GC的T3-T4期，並伴有淋巴結轉移。透過IHC對Cldn18-ATK腫瘤和轉移灶與人類GC的詳細比較顯示，兩者在組織學特徵和通路啟用狀態方面具有高度相似性。由此表明Cldn18-ATK可以精確模擬晚期人類腺癌。
Lgr5是包括胃在內的各種組織中的上皮幹細胞標記物，Lgr5+幹細胞是上皮細胞癌（包括結腸癌和胃癌）的來源，而胃腸道癌症中的腫瘤駐留Lgr5+（TR-Lgr5+）細胞群可作為腫瘤幹細胞驅動疾病的發展。本文研究人員將Lgr5-DTR-GFP（5DTR）等位基因整合到上述轉移性小鼠模型（Cldn18-LATK）中，在視覺化內源性TR-Lgr5+幹細胞樣細胞（TR-Lgr5+ SC）的同時促進其選擇性消融，從而用來評估TR-Lgr5+ SC在GC進展的各個階段中的作用。實驗結果顯示，在疾病開始的早期階段，TR-Lgr5+ SC丰度顯著增加，到腫瘤形成期達到峰值。之後，隨著病情的發展，其相對丰度逐漸下降。同樣的，侵襲區域也駐留了Lgr5+細胞群，其丰度在疾病發展期間下降。隨後，研究人員對Cldn18-LATK小鼠給予他莫昔芬誘導，2個月後給予白喉毒素（DT），每週1次，持續2周，以在侵襲和轉移開始之前去除原發性腫瘤中的TR-Lgr5+ SC。與DT未處理小鼠相比，DT處理小鼠的原發性腫瘤顯著縮小，侵襲性腫瘤和肝轉移幾乎消失。由此確定了TR-Lgr5+ SC在促進GC進展和轉移發生中的關鍵作用。然而，僅僅短暫的急性消除TR-Lgr5+ SC時卻不能長期改善腫瘤生長，因為雖然在腫瘤中消除TR-Lgr5+ SC能在一開始有效減少原發腫瘤負擔和轉移，但腫瘤透過快速生成新的TR-Lgr5+ SC進行補償，從而比未經DT處理的腫瘤更能促進腫瘤的形成和擴散。不過，研究人員證實在已建立的胃癌中持續且頻繁地消耗TR-Lgr5+ SC能非常有效地改善疾病的進展。最後，考慮到胃癌固有的透過可塑性機制（包括過度增殖）部分補償TR-Lgr5+ SC急性丟失的能力，研究人員發現聯合TR-Lgr5+ SC消除和常規化療（5-氟尿嘧啶）可以更有效地阻斷GC生長和轉移（圖2）。
圖2
最後，為了避免體內全身消除正常Lgr5+ SC相關的毒性，研究人員採用了一種將腫瘤類器官原位移植（OT）到免疫缺陷NOD-Scid-Gamma（NSG）小鼠胃黏膜下層的模型。實驗結果表明，該OT模型中的腫瘤和轉移再現了內源性腫瘤的組織學和分子特徵。將Cldn18-LATK小鼠模型中的消除TR-Lgr5+ SC的策略同樣應用到OT模型中，也能得出類似的結論。此外，比較未經DT處理（Lgr5+）和經DT處理（Lgr5-）的腫瘤類器官在經脾臟注射到NSC小鼠後產生肝臟和肺轉移的能力發現後者幾乎無轉移，提示TR-Lgr5+細胞負責播散轉移。
綜上所述，本研究描述了一種可以有效且選擇性地針對胃腸道內胃上皮的所有隔室進行基因重組的Cldn18-IRES-CreERT2等位基因，利用在此基礎上構建的晚期GC模型，確定了TR-Lgr5+ SC對體內GC的發生、進展和轉移具有重要貢獻，突出強調了開發靶向人類內源性TR-Lgr5+ SC群的治療藥物的巨大臨床潛力。毫無疑問，這些模型對於旨在進一步定義GC進展的潛在臨床相關機制、確定更有效的診斷和治療方法以及用於臨床前篩查應用的研究具有重要意義。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41556-021-00793-9
製版人：十一
參考文獻
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2. Grabsch, H. I. & Tan, P. Gastric cancer pathology and underlying molecular mechanisms. Dig. Surg. 30, 150–158 (2013).
